人毛囊干細胞

一,、細胞基本屬性

培養(yǎng)基：含FBS,、生長添加劑、Penicillin,、Streptomycin等

傳代特性：可傳3-5代左右

消化液：0.25%胰dan白酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

細胞簡介：人毛囊干細胞分離自皮膚毛囊組織,；毛囊是表皮細胞連續(xù)形成的袋樣上皮。其基底是真皮凹進的真皮毛乳頭,，中心是一根毛發(fā),，立毛肌的一側(cè)斜附在毛囊壁上，附著點的上方為皮脂腺通入毛囊的短頸,，毛囊在皮膚表面的開口是毛囊孔,。毛囊位于真皮和皮下組織中，毛囊向下伸入真皮約有一厘米深度,，它是由包繞毛發(fā)與表皮相連的上皮鞘,，以及皮脂腺和立毛肌所組成的一個結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的器官附件組織。毛囊干細胞是在人的毛囊外根鞘隆突部中的一種細胞,。毛囊干細胞屬于成體干細胞,，在體內(nèi)處于靜止狀態(tài)，在體外培養(yǎng)作用下表現(xiàn)出驚人的增殖能力,。研究發(fā)現(xiàn),，毛囊干細胞具有多向分化潛能，它可以分化成表皮,、毛囊,、皮脂腺，參與皮膚創(chuàng)傷愈合的過程,。毛囊干細胞和其它成體干細胞一樣,，具有慢周期性、未分化性、自我更新和體外增殖能力強等特點,。毛囊干細胞分化經(jīng)毛囊干細胞(hair follicle stem cells,，F(xiàn)SC)、短暫增殖細胞(transit amplifying cells,，TAC)有絲分裂后分化細胞(postmitotic differentiating cells,，PDC)三個階段。毛囊干細胞在光鏡下呈立方形,，細胞體積小,，核漿比率大，表面光滑,，皺褶少,，又被稱為非鋸齒形細胞，細胞體積的增大與增殖能力呈負相關(guān),。超微結(jié)構(gòu)顯示細胞表面有少許微絨毛,，細胞核存在許多卷曲，染色質(zhì)彌散分布,，這些形態(tài)特征均表現(xiàn)出原始細胞的特性,。
原代細胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機體中取出，經(jīng)胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細胞,，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),，使細胞繁殖到一定系數(shù)后進行細胞鑒定。

實驗步驟：

一,、取7-10d雄性SD大鼠,，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二,、在超凈工作臺中,，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,，去除小腦和間腦,。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管,，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,。

四、用細解剖鑷去除大腦白質(zhì),、殘余大血管和軟腦膜,，保留大腦皮質(zhì)。

五,、大腦皮質(zhì)放于DMEM中,，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶,，0 .025-0 .05％IV型膠原酶,，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h,。

六,、室溫1 000×g離心8min，去上清液,。

七,、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻,，1 000×g,，20min,，4℃離心,，去上清。

八,、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶,，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮,，混勻,，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min,，去上清液,。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻,，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g,，60min，4℃),，1000×g,，4℃離心10min。

十,、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min,，室溫),，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS,，4ug/ml素 )重懸浮,，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基,，隨后隔天換液,。

注意事項：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個月。

2. 在細胞培養(yǎng)過程中,，請注意保持無菌操作,。

3. 傳代培養(yǎng)過程中，yi酶消化時間不宜過長,，否則會影響細胞貼壁及其生長狀態(tài),。

4. 建議客戶收到細胞后前3天每個倍數(shù)各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài),，便于和技術(shù)部溝通,；由于運輸?shù)脑颍瑐€別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況,，請及時和我們聯(lián)系,，詳盡告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤,、回訪直至問題得到解決,。
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