小鼠股動脈內皮細胞

一、細胞基本屬性

培養(yǎng)基：原代內皮細胞培養(yǎng)體系

傳代特性：根據(jù)細胞特性

消化液：0.25%胰dan白酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

細胞簡介：股動脈是下肢動脈的主干,，由髂外動脈延續(xù)而來。在腹股溝韌帶中點的深面入股三角,。在股三角內,，股動脈先位于股靜脈的外側，逐漸從外側跨到股靜脈的前方,，下行入收肌管,，再穿收肌腱裂孔至腘窩，易名腘動脈,。股動脈在腹股溝中點處位置表淺,，可摸到搏動，是臨床上急救壓迫止血和進行穿刺的部位,。

股動脈動脈內皮細胞組成了動脈內壁,，并持續(xù)受到血流剪切應力的影響。內皮細胞在切應力的作用下,，分泌不同的內皮因子并進而影響血管收縮和生長,。主動脈內皮細胞也調節(jié)細胞黏附分子的表達來控制和精確調節(jié)炎癥反應和組織纖維化。體外培養(yǎng)的原代股動脈內皮細胞可有效地幫助研究者研究內皮功能失調的機理,，動脈粥樣化等疾病的發(fā)病機理以及發(fā)展新的治療方法,。
原代細胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機體中取出，經胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細胞,，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),，使細胞繁殖到一定系數(shù)后進行細胞鑒定。

實驗步驟：

一,、取7-10d雄性SD大鼠,，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二,、在超凈工作臺中,，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中,，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,，去除小腦和間腦。

三,、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管,，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,。

四、用細解剖鑷去除大腦白質,、殘余大血管和軟腦膜,，保留大腦皮質。

五,、大腦皮質放于DMEM中,，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中,，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶,，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI),，混勻后37℃水浴消化1-1.5h,。

六、室溫1 000×g離心8min,，去上清液,。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮,，充分混勻,，1 000×g，20min,，4℃離心,，去上清。

八,、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶,，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮,，混勻,，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min,，去上清液,。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻,，鋪于經離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g,，60min，4℃),，1000×g,，4℃離心10min。

十,、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm,，6min，室溫),，去上清液,。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml素 )重懸浮,，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養(yǎng)皿中,，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基,，隨后隔天換液,。

注意事項：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個月。

2. 在細胞培養(yǎng)過程中,，請注意保持無菌操作,。

3. 傳代培養(yǎng)過程中，yi酶消化時間不宜過長,，否則會影響細胞貼壁及其生長狀態(tài),。

4. 建議客戶收到細胞后前3天每個倍數(shù)各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài),，便于和技術部溝通,；由于運輸?shù)脑颍瑐€別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況,，請及時和我們聯(lián)系,，詳盡告知細胞的具體情況，以便我們的技術人員跟蹤,、回訪直至問題得到解決,。
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