小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞的相關(guān)產(chǎn)品：兔腸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞大鼠骨髓肥大細(xì)胞大鼠骨髓單核細(xì)胞大鼠脾淋巴細(xì)胞大鼠骨髓巨噬細(xì)胞大鼠脊髓微血管內(nèi)皮細(xì)胞大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞大鼠腦動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞大鼠腦血管周細(xì)胞大鼠腦膜細(xì)胞大鼠腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞大鼠三叉神經(jīng)元細(xì)胞大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞

小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞

一,、細(xì)胞基本屬性

 

培養(yǎng)基：含FBS、生長(zhǎng)添加劑,、Penicillin,、Streptomycin等

傳代特性：可傳3代左右

消化液：0.25%胰dan白酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

細(xì)胞簡(jiǎn)介：小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞分離自眼角膜組織,；角膜位于眼球前壁的一層透明膜，約占纖維膜的前1/6,，從后面看角膜呈正圓形,，從前面看為橫橢圓形。角膜厚度各部分不盡相同,，中央部薄,。角膜有十分敏感的神經(jīng)末梢，如有外物接觸角膜,，眼瞼便會(huì)不由自主地合上以保護(hù)眼睛,。為了保持透明，角膜并沒(méi)有血管,，透過(guò)外界空氣,、淚液及房水獲取養(yǎng)份及氧氣。角膜分為五層,，由前向后依次為：上皮細(xì)胞層,、前彈力層、基質(zhì)層,、后彈力層,、內(nèi)皮細(xì)胞層。角膜基質(zhì)層是角膜的主要組成部分,，占據(jù)角膜厚度的90%,，由角膜基質(zhì)細(xì)胞、膠原纖維和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成,。角膜基質(zhì)層缺損的修復(fù)主要由角膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖及分泌細(xì)胞外基質(zhì)完成,。角膜基質(zhì)層具有結(jié)構(gòu)規(guī)整，透明度高的特點(diǎn),，正常情況下角膜基質(zhì)細(xì)胞分泌組成基質(zhì)層的成分,，維持角膜的透明度，此細(xì)胞對(duì)于角膜損傷的修復(fù)具有重要意義,。角膜基質(zhì)細(xì)胞,，存在于角膜基質(zhì)層中，在正常情況下,，處于靜止?fàn)顟B(tài),。但當(dāng)角膜損傷時(shí)，不同上皮來(lái)源的因子及環(huán)境信號(hào),，將影響角膜基質(zhì)細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng),，決定著角膜能否被修復(fù),。
原代細(xì)胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機(jī)體中取出，經(jīng)胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細(xì)胞,，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞繁殖到一定系數(shù)后進(jìn)行細(xì)胞鑒定,。

實(shí)驗(yàn)步驟：

一,、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min,。

二,、在超凈工作臺(tái)中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中,，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,，去除小腦和間腦。

三,、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)以去除軟腦膜和腦膜大血管,，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四,、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì),、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì),。

五,、大腦皮質(zhì)放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小,，放入50ml的離心管中,，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶,，200-400U DNaseI),，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六,、室溫1 000×g離心8min,，去上清液。

七,、沉淀中加入20％BSA重懸浮,，充分混勻，1 000×g,，20min,，4℃離心，去上清,。

八,、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶,，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮,，混勻,，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min,，去上清液,。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻,，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g,，60min，4℃),，1000×g,，4℃離心10min。

十,、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min,，室溫),，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS,，4ug/ml素 )重懸浮,，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過(guò)夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃,、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基,，隨后隔天換液。

注意事項(xiàng)：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個(gè)月,。

2. 在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,，請(qǐng)注意保持無(wú)菌操作。

3. 傳代培養(yǎng)過(guò)程中,，yi酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),，否則會(huì)影響細(xì)胞貼壁及其生長(zhǎng)狀態(tài)。

4. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天每個(gè)倍數(shù)各拍幾張細(xì)胞照片,，記錄細(xì)胞狀態(tài),，便于和技術(shù)部溝通；由于運(yùn)輸?shù)脑?，個(gè)別敏感細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況,，請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系，詳盡告知細(xì)胞的具體情況,，以便我們的技術(shù)人員跟蹤,、回訪直至問(wèn)題得到解決,。
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