小鼠角膜基質(zhì)細胞的相關(guān)產(chǎn)品：兔腸動脈內(nèi)皮細胞大鼠骨髓肥大細胞大鼠骨髓單核細胞大鼠脾淋巴細胞大鼠骨髓巨噬細胞大鼠脊髓微血管內(nèi)皮細胞大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞大鼠腦動脈血管內(nèi)皮細胞大鼠腦血管周細胞大鼠腦膜細胞大鼠腦皮層神經(jīng)元細胞大鼠海馬神經(jīng)元細胞大鼠脊髓神經(jīng)元細胞大鼠三叉神經(jīng)元細胞大鼠星形膠質(zhì)細胞

小鼠角膜基質(zhì)細胞

一、細胞基本屬性

 

培養(yǎng)基：含FBS,、生長添加劑,、Penicillin、Streptomycin等

傳代特性：可傳3代左右

消化液：0.25%胰dan白酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%,；CO2,，5%

細胞簡介：小鼠角膜基質(zhì)細胞分離自眼角膜組織；角膜位于眼球前壁的一層透明膜,，約占纖維膜的前1/6,，從后面看角膜呈正圓形，從前面看為橫橢圓形,。角膜厚度各部分不盡相同,，中央部薄。角膜有十分敏感的神經(jīng)末梢,，如有外物接觸角膜,，眼瞼便會不由自主地合上以保護眼睛。為了保持透明,，角膜并沒有血管,，透過外界空氣、淚液及房水獲取養(yǎng)份及氧氣,。角膜分為五層,，由前向后依次為：上皮細胞層、前彈力層,、基質(zhì)層,、后彈力層,、內(nèi)皮細胞層,。角膜基質(zhì)層是角膜的主要組成部分，占據(jù)角膜厚度的90%,，由角膜基質(zhì)細胞,、膠原纖維和細胞外基質(zhì)構(gòu)成。角膜基質(zhì)層缺損的修復(fù)主要由角膜基質(zhì)細胞的增殖及分泌細胞外基質(zhì)完成,。角膜基質(zhì)層具有結(jié)構(gòu)規(guī)整,，透明度高的特點，正常情況下角膜基質(zhì)細胞分泌組成基質(zhì)層的成分,，維持角膜的透明度,，此細胞對于角膜損傷的修復(fù)具有重要意義。角膜基質(zhì)細胞,，存在于角膜基質(zhì)層中,，在正常情況下，處于靜止狀態(tài),。但當(dāng)角膜損傷時,，不同上皮來源的因子及環(huán)境信號，將影響角膜基質(zhì)細胞的應(yīng)答反應(yīng),，決定著角膜能否被修復(fù),。
原代細胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機體中取出,，經(jīng)胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細胞，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),，使細胞繁殖到一定系數(shù)后進行細胞鑒定,。

實驗步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠,，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min,。

二、在超凈工作臺中,，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中,，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦,。

三,、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,。

四,、用細解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜,，保留大腦皮質(zhì),。

五、大腦皮質(zhì)放于DMEM中,，剪碎成約1mm3大小,，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶,，0 .025-0 .05％IV型膠原酶,，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h,。

六,、室溫1 000×g離心8min，去上清液,。

七,、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻,，1 000×g,，20min，4℃離心,，去上清,。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶,，0.05-0.1％I型膠原酶,，100-300U DNaseI )重懸浮,，混勻，37℃水浴消化0.5-1h,，700×g室溫離心6min,，去上清液。

九,、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻,，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min,，4℃),，1000×g，4℃離心10min,。

十,、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm,，6min,，室溫)，去上清液,。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS,，4ug/ml素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養(yǎng)皿中,，置于37℃,、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液,。

注意事項：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個月,。

2. 在細胞培養(yǎng)過程中,，請注意保持無菌操作,。

3. 傳代培養(yǎng)過程中，yi酶消化時間不宜過長,，否則會影響細胞貼壁及其生長狀態(tài),。

4. 建議客戶收到細胞后前3天每個倍數(shù)各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài),，便于和技術(shù)部溝通,；由于運輸?shù)脑颍瑐€別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況,，請及時和我們聯(lián)系,，詳盡告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤,、回訪直至問題得到解決,。
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