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小鼠軟骨細胞

一,、細胞基本屬性

 

培養(yǎng)基：含FBS,、生長添加劑,、Penicillin、Streptomycin等

傳代特性：可傳2-3代左右

消化液：0.25%胰dan白酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

傳代比例：1:2

細胞簡介：小鼠軟骨細胞分離自軟骨組織,；軟骨組織由軟骨細胞,、基質及纖維構成。軟骨組織再生能力強,，這些增生的幼稚細胞形似纖維母細胞,，以后逐漸變?yōu)檐浌悄讣毎⑿纬绍浌腔|,，細胞被埋在軟骨陷窩內而變?yōu)殪o止的軟骨細胞,。根據軟骨組織內所含纖維成分的不同，可將軟骨分為透明軟骨,、彈性軟骨和纖維軟骨三種,，其中以透明軟骨的分布較廣，結構也較典型。軟骨細胞(chondrocyte)位于軟骨陷窩內,。幼稚的軟骨細胞位于軟骨組織的表層,，單個分布，體積較小,，呈橢圓形,，長軸與軟骨表面平行，越向深層的軟骨細胞體積之間增大呈圓形,，細胞核圓形或卵圓形,，染色淺，細胞質弱嗜堿性,，常見數量不一的脂滴,。成熟的軟骨細胞多2-8個成群分布于軟骨陷窩內，這些軟骨細胞由同一個母細胞分裂增殖而成,，稱為同源細胞群,。電鏡下，軟骨細胞有突起和皺褶,，細胞質內有大量的粗面內質網和發(fā)達的高爾基復合體及少量的線粒體,。在組織切片中，軟骨細胞收縮為不規(guī)則形,，在軟骨囊和細胞之間出現較大的腔隙,。體外培養(yǎng)的軟骨細胞對于研究其生理功能、藥物作用以及各種致病因素作用下的病理生理改變具重要意義,。
原代細胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機體中取出,，經胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細胞，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),，使細胞繁殖到一定系數后進行細胞鑒定,。

實驗步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠,，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min,。

二、在超凈工作臺中,，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中,，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦,。

三,、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,。

四,、用細解剖鑷去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質,。

五,、大腦皮質放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小,，放入50ml的離心管中,，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶,，200-400U DNaseI),，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六,、室溫1 000×g離心8min,，去上清液。

七,、沉淀中加入20％BSA重懸浮,，充分混勻，1 000×g,，20min,，4℃離心，去上清,。

八,、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶,，100-300U DNaseI )重懸浮,，混勻，37℃水浴消化0.5-1h,，700×g室溫離心6min，去上清液,。

九,、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g,，60min,，4℃)，1000×g,，4℃離心10min,。

十、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm,，6min，室溫)，去上清液,。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS,，4ug/ml素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養(yǎng)皿中,，置于37℃,、5％CO2培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液,。

注意事項：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個月,。

2. 在細胞培養(yǎng)過程中，請注意保持無菌操作,。

3. 傳代培養(yǎng)過程中,，yi酶消化時間不宜過長，否則會影響細胞貼壁及其生長狀態(tài),。

4. 建議客戶收到細胞后前3天每個倍數各拍幾張細胞照片,，記錄細胞狀態(tài)，便于和技術部溝通,；由于運輸的原因,，個別敏感細胞會出現不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯系,，詳盡告知細胞的具體情況,，以便我們的技術人員跟蹤、回訪直至問題得到解決,。
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