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小鼠心肌成纖維細胞

一、細胞基本屬性

 

培養(yǎng)基：含FBS,、生長添加劑,、Penicillin、Streptomycin等

傳代特性：可傳2代左右

消化液：0.25%胰dan白酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

細胞簡介：小鼠心肌成纖維細胞分離自心臟組織,；心臟由心肌細胞和非心肌細胞組成,，非心肌細胞占細胞總數(shù)的70%，其中90%以上的非心肌細胞由心肌成纖維細胞組成,。成纖維細胞(Fibroblast)是疏松結(jié)締組織的主要細胞成分,，由胚胎時期的間充質(zhì)細胞分化而來。成纖維細胞較大,，輪廓清楚,，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu)，其細胞核呈規(guī)則的卵圓形,，核仁大而明顯,。成纖維細胞功能活動旺盛，細胞質(zhì)嗜弱堿性,，具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動,，在一定條件下，它可以實現(xiàn)跟纖維細胞的互相轉(zhuǎn)化,；成纖維細胞對不同程度的細胞變性,、壞死和組織缺損的修復(fù)有著十分重要的作用。剛分離的心肌成纖維細胞呈圓形,、折光性良好,，懸浮于培養(yǎng)基中。30min細胞貼壁,，其中部分開始伸出偽足,，表現(xiàn)為小的突起；6h后細胞基本貼壁，伸展成梭形,，胞核清晰,，分布較均勻，散在生長,，不聚集成團,；細胞生長迅速，5-7天即呈融合狀態(tài),，細胞排列緊密,，有的交叉重疊生長，平坦,、胞體較大,，細胞質(zhì)透明，細胞核較大,，呈橢圓形,，顏色淡。細胞融合,，并彼此連接成網(wǎng)狀,；細胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布。近年來,，人們逐漸了解到非心肌細胞不僅對心肌細胞具有結(jié)構(gòu)上的支持,、保護作用，而且還具有自分泌和旁分泌功能,，影響心肌細胞的結(jié)構(gòu)和生理功能,；心肌成纖維細胞主要功能為對心肌細胞起結(jié)構(gòu)支持作用并負責細胞基質(zhì)外的合成，當心肌損傷時能產(chǎn)生旁分泌生長因子,。心肌成纖維細胞是心臟結(jié)締組織中常見的細胞,，可合成和分泌膠原纖維、彈性纖維,、網(wǎng)狀纖維及有機基質(zhì),，并且在外傷等因素刺激下，部分纖維細胞可重新轉(zhuǎn)變?yōu)橛字傻某衫w維細胞,，其功能活動也得以恢復(fù),，參與組織損傷后的修復(fù)。因此,，對心肌成纖維細胞的生理學研究成為現(xiàn)代心血管領(lǐng)域研究的一個重點,。
原代細胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機體中取出，經(jīng)胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細胞,，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),，使細胞繁殖到一定系數(shù)后進行細胞鑒定,。

實驗步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠,，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min,。

二、在超凈工作臺中,，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中,，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦,。

三,、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,。

四、用細解剖鑷去除大腦白質(zhì),、殘余大血管和軟腦膜,，保留大腦皮質(zhì)。

五,、大腦皮質(zhì)放于DMEM中,，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中,，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶,，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI),，混勻后37℃水浴消化1-1.5h,。

六、室溫1 000×g離心8min,，去上清液,。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮,，充分混勻,，1 000×g，20min,，4℃離心,，去上清。

八,、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶,，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮,，混勻,，37℃水浴消化0.5-1h,，700×g室溫離心6min，去上清液,。

九,、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g,，60min,，4℃)，1000×g,，4℃離心10min,。

十、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm,，6min，室溫),，去上清液,。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml素 )重懸浮,，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養(yǎng)皿中,，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基,，隨后隔天換液,。

注意事項：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個月。

2. 在細胞培養(yǎng)過程中,，請注意保持無菌操作,。

3. 傳代培養(yǎng)過程中，yi酶消化時間不宜過長,，否則會影響細胞貼壁及其生長狀態(tài),。

4. 建議客戶收到細胞后前3天每個倍數(shù)各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài),，便于和技術(shù)部溝通,；由于運輸?shù)脑颍瑐€別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況,，請及時和我們聯(lián)系,，詳盡告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤,、回訪直至問題得到解決,。
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