人胎盤微血管內皮細胞

培養(yǎng)基：原代內皮細胞培養(yǎng)體系

傳代特性：細胞特性確定傳代

消化液：0.25%胰dan白酶

培養(yǎng)條件：氣相：  空氣,，95%,；CO2 ，5%

細胞簡介：胎盤是人類妊娠期間由胚膜和母體子宮內膜聯(lián)合長成的母子間交換物質的器官,。 胎兒在子宮中發(fā)育,，  依靠胎盤從母體取得營養(yǎng)，而雙方保持相當?shù)莫毩⑿浴? 胎盤 對胎兒的正常發(fā)育起著至關重要的作用,，  而良好的胎盤血管網絡的形成,，是維持 正常妊娠的前提。作為胎盤血管床的主要構成部分之一,，  胎盤微血管內皮細胞參 與胎盤血管形成與重塑,、調節(jié)血管舒縮，  在維持胎盤血管床的血流穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著 重要作用,。
一,、細胞基本屬性

原代細胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機體中取出,，經胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細胞,，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞繁殖到一定系數(shù)后進行細胞鑒定,。

實驗步驟：

一,、取7-10d雄性SD大鼠,，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二,、在超凈工作臺中,，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,，去除小腦和間腦。

三,、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管,，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四,、用細解剖鑷去除大腦白質,、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質,。

五,、大腦皮質放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小,，放入50ml的離心管中,，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶,，200-400U DNaseI),，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六,、室溫1 000×g離心8min,，去上清液。

七,、沉淀中加入20％BSA重懸浮,，充分混勻，1 000×g,，20min,，4℃離心，去上清,。

八,、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶,，100-300U DNaseI )重懸浮,，混勻，37℃水浴消化0.5-1h,，700×g室溫離心6min,，去上清液,。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻,，鋪于經離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g,，60min，4℃),，1000×g,，4℃離心10min。

十,、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min,，室溫),，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS,，4ug/ml素 )重懸浮,，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃,、5％CO2培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基,，隨后隔天換液。

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注意事項：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個月,。

2. 在細胞培養(yǎng)過程中,，請注意保持無菌操作。

3. 傳代培養(yǎng)過程中,，yi酶消化時間不宜過長,，否則會影響細胞貼壁及其生長狀態(tài)。

4. 建議客戶收到細胞后前3天每個倍數(shù)各拍幾張細胞照片,，記錄細胞狀態(tài),，便于和技術部溝通；由于運輸?shù)脑?，個別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況,，請及時和我們聯(lián)系，詳盡告知細胞的具體情況,，以便我們的技術人員跟蹤,、回訪直至問題得到解決。