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人輸卵管上皮細(xì)胞

一、細(xì)胞基本屬性

 

培養(yǎng)基：原代上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系

傳代特性：細(xì)胞特性確定傳代

消化液：0.25%胰dan白酶

細(xì)胞簡介：輸卵管位于人體的盆腔內(nèi),，一般的人有兩條，  左,、右輸卵管各位于子宮一側(cè),。它  們由子宮底外側(cè)角部向外，平行伸展,，先達(dá)卵巢的子宮端,，再沿卵巢系膜緣上行  至卵巢的輸卵管端，  且呈弓形而覆蓋于卵巢上,，然后向下,、向內(nèi)行，終止于卵巢  的游離緣及其內(nèi)側(cè)面上部。粘膜層的上皮為單層高柱狀細(xì)胞所構(gòu)成,，上皮細(xì)胞可  分為4種不同類型：纖毛細(xì)胞,、分泌細(xì)胞、楔形細(xì)胞和未分化細(xì)胞,。  輸卵管是卵子 運(yùn)輸,、儲存、獲能,，  以及卵母細(xì)胞采取,、運(yùn)送、成熟,、受精和早期胚胎發(fā)育的重  要場所,。輸卵管上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)可以用于飼養(yǎng)層細(xì)胞，  與胚胎共培養(yǎng),，克服胚  胎的發(fā)育阻滯現(xiàn)象,。因此，體外培養(yǎng)輸卵管上皮細(xì)胞,，不但可以進(jìn)一步了解影響  生殖微環(huán)境變化的因素,，  而且還可以建立輸卵管上皮細(xì)胞與胚胎共培養(yǎng)體系，研  究輸卵管上皮細(xì)胞對胚胎體外發(fā)育的影響,。
原代細(xì)胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機(jī)體中取出,，經(jīng)胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細(xì)胞，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),，使細(xì)胞繁殖到一定系數(shù)后進(jìn)行細(xì)胞鑒定,。

實(shí)驗(yàn)步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠,，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min,。

二、在超凈工作臺中,，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中,，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦,。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管,，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,。

四、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì),、殘余大血管和軟腦膜,，保留大腦皮質(zhì)。

五、大腦皮質(zhì)放于DMEM中,，剪碎成約1mm3大小,，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶,，0 .025-0 .05％IV型膠原酶,，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h,。

六,、室溫1 000×g離心8min，去上清液,。

七,、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻,，1 000×g,，20min，4℃離心,，去上清,。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶,，0.05-0.1％I型膠原酶,，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻,，37℃水浴消化0.5-1h,，700×g室溫離心6min，去上清液,。

九,、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g,，60min,，4℃)，1000×g,，4℃離心10min,。

十、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm,，6min，室溫),，去上清液,。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS,，4ug/ml素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，置于37℃,、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液,。

注意事項(xiàng)：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個月,。

2. 在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，請注意保持無菌操作,。

3. 傳代培養(yǎng)過程中,，yi酶消化時間不宜過長，否則會影響細(xì)胞貼壁及其生長狀態(tài),。

4. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天每個倍數(shù)各拍幾張細(xì)胞照片,，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和技術(shù)部溝通,；由于運(yùn)輸?shù)脑?，個別敏感細(xì)胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系,，詳盡告知細(xì)胞的具體情況,，以便我們的技術(shù)人員跟蹤、回訪直至問題得到解決,。
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