大鼠大隱靜脈內(nèi)皮細胞

培養(yǎng)基：含FBS、生長添加劑,、Penicillin,、Streptomycin等

包被條件：PLL(0.1mg/ml)，明膠(0.1%)

傳代特性：可傳2-3代

消化液：0.25%胰dan白酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

傳代比例：1:2

細胞簡介：大鼠大隱靜脈內(nèi)皮細胞分離自大隱靜脈,；大隱靜脈起于足背靜脈弓內(nèi)側(cè)端，經(jīng)內(nèi)踝前方,，沿小腿內(nèi)側(cè)緣伴隱神經(jīng)上行,，經(jīng)股骨內(nèi)側(cè)髁后方，進入大腿內(nèi)側(cè)部,，與股內(nèi)側(cè)皮神經(jīng)伴行,，逐漸向前上，在恥骨結(jié)節(jié)外下方穿隱靜脈裂孔,，匯入股靜脈,，其匯入點稱為隱股點。有5條屬支：旋髂淺靜脈、腹壁淺靜脈,、股內(nèi)側(cè)淺靜脈和股外側(cè)淺靜脈,，它們匯入大隱靜脈的形式多樣，相互間吻合豐富,。大隱靜脈曲張行高位結(jié)扎時,，須分別結(jié)扎、切斷各屬支,，以防復(fù)發(fā),。大隱靜脈內(nèi)皮細胞對維持大隱靜脈動態(tài)平衡起著重要作用。它們合成,、分泌凝血和纖溶系統(tǒng)的激活因子和抑制因子,、影響血小板粘附和聚集的調(diào)節(jié)因子；大隱靜脈內(nèi)皮細胞還釋放控制細胞增殖和調(diào)節(jié)血管壁緊張度的分子,。
一,、細胞基本屬性

原代細胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機體中取出，經(jīng)胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細胞,，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),，使細胞繁殖到一定系數(shù)后進行細胞鑒定。

實驗步驟：

一,、取7-10d雄性SD大鼠,，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二,、在超凈工作臺中,，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,，去除小腦和間腦,。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管,，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,。

四、用細解剖鑷去除大腦白質(zhì),、殘余大血管和軟腦膜,，保留大腦皮質(zhì)。

五,、大腦皮質(zhì)放于DMEM中,，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中,，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶,，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h,。

六,、室溫1 000×g離心8min，去上清液,。

七,、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻,，1 000×g,，20min，4℃離心,，去上清,。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶,，0.05-0.1％I型膠原酶,，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻,，37℃水浴消化0.5-1h,，700×g室溫離心6min，去上清液,。

九,、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g,，60min,，4℃)，1000×g,，4℃離心10min,。

十、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm,，6min，室溫),，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS,，4ug/ml素 )重懸浮,，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃,、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基,，隨后隔天換液。

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注意事項：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個月。

2. 在細胞培養(yǎng)過程中,，請注意保持無菌操作,。

3. 傳代培養(yǎng)過程中，yi酶消化時間不宜過長,，否則會影響細胞貼壁及其生長狀態(tài),。

4. 建議客戶收到細胞后前3天每個倍數(shù)各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài),，便于和技術(shù)部溝通,；由于運輸?shù)脑颍瑐€別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況,，請及時和我們聯(lián)系,，詳盡告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤,、回訪直至問題得到解決,。