大鼠腸微血管內(nèi)皮細胞

一,、細胞基本屬性

培養(yǎng)基：含FBS、生長添加劑,、Penicillin,、Streptomycin等

包被條件：PLL(0.1mg/ml)，明膠(0.1%)

傳代特性：可傳2-3代

消化液：0.25%胰dan白酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

細胞簡介：大鼠腸微血管內(nèi)皮細胞分離自腸道組織,；腸道指的是從胃幽門至的消化管,。腸是消化管中長的一段，也是功能重要的一段,。哺乳動物的腸包括小腸,、大腸和直腸3大段。大量的消化作用和幾乎全部消化產(chǎn)物的吸收都是在小腸內(nèi)進行的,，大腸主要濃縮食物殘渣,，形成糞便,，再通過直腸經(jīng)排出體外。腸道堪稱身體勞累的器官——每天不停地消化,、吸收食物,，以提供足夠的養(yǎng)分，其實它的功能還遠不止此——它還是機體內(nèi)大的微生態(tài)系統(tǒng),。微血管是極細微的血管,，管徑平均為6-9μm，連于動,、靜脈之間,，互相連接成網(wǎng)狀。微血管壁薄,，管徑較小,，血流很慢，通透性大,。其功能是利于血液與組織之間進行物質交換,。其管壁主要由一層內(nèi)皮細胞構成，在內(nèi)皮外面有一薄層結締組織,。另外還?？梢姷揭环N扁而有突起的細胞貼在微血管的管壁外面，稱為周細胞,。
原代細胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機體中取出,，經(jīng)胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細胞，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),，使細胞繁殖到一定系數(shù)后進行細胞鑒定,。

實驗步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠,，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min,。

二、在超凈工作臺中,，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中,，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦,。

三,、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,。

四,、用細解剖鑷去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質,。

五,、大腦皮質放于DMEM中,，剪碎成約1mm3大小,，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶,，0 .025-0 .05％IV型膠原酶,，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h,。

六,、室溫1 000×g離心8min，去上清液,。

七,、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻,，1 000×g,，20min，4℃離心,，去上清,。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶,，0.05-0.1％I型膠原酶,，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻,，37℃水浴消化0.5-1h,，700×g室溫離心6min，去上清液,。

九,、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g,，60min,，4℃)，1000×g,，4℃離心10min,。

十、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm,，6min，室溫)，去上清液,。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS,，4ug/ml素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養(yǎng)皿中,，置于37℃,、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液,。

注意事項：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個月,。

2. 在細胞培養(yǎng)過程中，請注意保持無菌操作,。

3. 傳代培養(yǎng)過程中,，yi酶消化時間不宜過長，否則會影響細胞貼壁及其生長狀態(tài),。

4. 建議客戶收到細胞后前3天每個倍數(shù)各拍幾張細胞照片,，記錄細胞狀態(tài)，便于和技術部溝通,；由于運輸?shù)脑?，個別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系,，詳盡告知細胞的具體情況,，以便我們的技術人員跟蹤、回訪直至問題得到解決,。
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