GFP小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生化+GFP的相關(guān)產(chǎn)品：大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞RWPE-2 人前列腺正常細(xì)胞SAOS-2人成骨肉瘤細(xì)胞SBC-2人小細(xì)胞肺癌SCaBER人膀胱鱗癌細(xì)胞SCC-9人類鱗狀上皮舌癌細(xì)胞SCC-25人口腔鱗癌細(xì)胞SHP-77人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞sh-sy5y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞sh-sy5y轉(zhuǎn)染突變型人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞sh-sy5y轉(zhuǎn)染野生型人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SIHa人子宮頸鱗癌細(xì)胞

GFP小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生化+GFP

一、細(xì)胞基本屬性

細(xì)胞詳述

 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,，對(duì)骨髓中的造血干細(xì)胞（HSC）不僅有機(jī)械支持作用,，還能分泌多種生長(zhǎng)因子（如IL-6，IL-11,，LIF,，M-CSF及SCF等）來(lái)支持造血,。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潛能,，能促進(jìn)間充質(zhì)組織的再生,，如：骨、軟骨,、肌肉,、韌帶、肌腱,、脂肪及基質(zhì)等組織,。

在骨髓中，BMSCs占骨髓有核細(xì)胞總數(shù)的0.001%~0.1%,，含量極低,。而同時(shí)，由于組織工程需要大量的種子細(xì)胞,，從嚙齒類動(dòng)物骨髓分離BMSCs的技術(shù)上的難度限制了許多實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展,。體外分離培養(yǎng)純度高、活力強(qiáng),、生物特性均一的BMSCs對(duì)組織工程及細(xì)胞的體內(nèi),、體外實(shí)驗(yàn)顯得至關(guān)重要。

該細(xì)胞通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶SV40+GFP基因,。

細(xì)胞篩選

該細(xì)胞為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP的細(xì)胞,，隨細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，其GFP熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸減弱,。若實(shí)驗(yàn)要求需要維持熒光強(qiáng)度,，可以加入嘌呤霉素進(jìn)行再次篩選,。         建議收到細(xì)胞后至少傳3代,，凍存留種后再進(jìn)行篩選。

初次進(jìn)行細(xì)胞篩選時(shí),，建議加入終濃度為1ug/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基維持培養(yǎng),，若無(wú)細(xì)胞漂浮或者漂浮較少，即可更換為含2ug/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)篩選,，以此類推,，至最高藥物濃度為5ug/ml。若篩選過(guò)程中,，漂浮細(xì)胞大于60%,，則停止篩選，換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng),，至細(xì)胞密度約80%,，可繼續(xù)加入同濃度嘌呤霉素進(jìn)行篩選,。當(dāng)加入5ug/ml嘌呤霉素時(shí)細(xì)胞正常增殖，可停止篩選,，用不含藥培養(yǎng)基正常培養(yǎng),。

細(xì)胞特性

1） 組織來(lái)源于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的正常骨髓血組織。

2） 細(xì)胞鑒定：CD44免疫熒光染色為陽(yáng)性,。

3） 經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高于90%,。

4） 不含有 HIV-1、 HBV,、HCV,、支原體、細(xì)菌,、酵母和真菌,。

5） 細(xì)胞生長(zhǎng)方式：長(zhǎng)梭形細(xì)胞，不規(guī)則細(xì)胞,，貼壁培養(yǎng),。

實(shí)驗(yàn)步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠,，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min,。

二、在超凈工作臺(tái)中,，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中,，打開(kāi)顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦,。

三,、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,。

四,、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜,，保留大腦皮質(zhì),。

五、大腦皮質(zhì)放于DMEM中,，剪碎成約1mm3大小,，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶,，0 .025-0 .05％IV型膠原酶,，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h,。

六,、室溫1 000×g離心8min,，去上清液。

七,、沉淀中加入20％BSA重懸浮,，充分混勻，1 000×g,，20min,，4℃離心，去上清,。

八,、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶,，100-300U DNaseI )重懸浮,，混勻，37℃水浴消化0.5-1h,，700×g室溫離心6min,，去上清液。

九,、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻,，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min,，4℃),，1000×g，4℃離心10min,。

十,、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm,，6min,，室溫)，去上清液,。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS,，4ug/ml素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過(guò)夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基,，隨后隔天換液,。

原代細(xì)胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機(jī)體中取出，經(jīng)胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細(xì)胞,，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),，使細(xì)胞繁殖到一定系數(shù)后進(jìn)行細(xì)胞鑒定,。

公司正在出售的產(chǎn)品：

 

注意事項(xiàng)：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個(gè)月。

2. 在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,，請(qǐng)注意保持無(wú)菌操作,。

3. 傳代培養(yǎng)過(guò)程中，yi酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),，否則會(huì)影響細(xì)胞貼壁及其生長(zhǎng)狀態(tài),。

4. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天每個(gè)倍數(shù)各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài),，便于和技術(shù)部溝通,；由于運(yùn)輸?shù)脑颍瑐€(gè)別敏感細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況,，請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系,，詳盡告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤,、回訪直至問(wèn)題得到解決,。