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排卵蛋白elisa方法說明書
閱讀：21 發(fā)布時(shí)間：2025-1-9| 提 供 商 | 上海撫生實(shí)業(yè)有限公司 | 資料大小 | 89KB |
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排卵蛋白elisa方法說明書
實(shí)驗(yàn)原理:
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中血清素/血清胺(ST)水平,。用純化的血清素/血清胺(ST)抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入血清素/血清胺(ST)，再與HRP標(biāo)記的血清素/血清胺(ST)抗體結(jié)合,，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,，經(jīng)過徹di洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶S的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的血清素/血清胺(ST)呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值）,，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中血清素/血清胺(ST)濃度,。
試劑盒特點(diǎn)：
1、高效,、靈敏、特異的抗體;
2,、穩(wěn)定的重復(fù)性和可靠性;
3、吸附性能好,，空白值低,，孔底透明度高的固相載體;
4,、適用血清、血漿,、組織勻漿液,、細(xì)胞培養(yǎng)上清液,、尿液等等多種標(biāo)本類型。
試劑盒性能：
1. 靈敏度：zui小的檢測(cè)濃度小于1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品,。稀釋度的線性,。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990,。
2. 特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。
3. 重復(fù)性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于10%,。
標(biāo)本要求:
1．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
2．不能檢測(cè)含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。
樣本處理及要求：
1.血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000g離心20分鐘,，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000g離心20分鐘,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱重后將組織剪碎,。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS,，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中,，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎,，或反復(fù)凍融,。將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(cè),。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g離心20分鐘,，取上清即可檢測(cè),，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
操作步驟：
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋,。
80pg/ml | 5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 | 150μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
40pg/ml | 4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 | 150μl的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
20pg/ml | 3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 | 150μl的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
10pg/ml | 2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 | 150μl的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
5pg/ml | 1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 | 150μl的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl,，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻,。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。
4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次，拍干,。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,，空白孔除外,。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5,。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色10分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測(cè)定：以空白孔調(diào)零,，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行,。
操作程序總結(jié)：
計(jì)算：
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),，OD值為縱坐標(biāo),，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度,。
注意事項(xiàng)：
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。
2．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果,。
3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器,，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差,。一次加樣時(shí)間最好控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。
4． 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，最好做復(fù)孔,。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染,。
6．底物請(qǐng)避光保存,。
7．嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
8．所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。
9．本試劑不同批號(hào)組分不得混用,。
保存條件及有效期：
1．試劑盒保存：；2-8℃,。
2．有效期：6個(gè)月