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糖原蛋白1elisa方法說明書
閱讀：194 發(fā)布時間：2024-8-7| 提 供 商 | 上海撫生實業(yè)有限公司 | 資料大小 | 89KB |
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糖原蛋白1elisa方法說明書
實驗原理:
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中血清素/血清胺(ST)水平。用純化的血清素/血清胺(ST)抗體包被微孔板,，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入血清素/血清胺(ST),，再與HRP標記的血清素/血清胺(ST)抗體結(jié)合,，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過徹di洗滌后加底物TMB顯色,。TMB在HRP酶S的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的血清素/血清胺(ST)呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，通過標準曲線計算樣品中血清素/血清胺(ST)濃度。
標本要求:
1．標本采集后盡早進行提取,，提取按相關(guān)文獻進行,，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,，可將標本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復凍融
2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。
樣本處理及要求：
1.血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復凍融,。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000g離心20分鐘,，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復凍融。
3. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果）,，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS,，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄,。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中,，于冰上充分研磨,。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎,，或反復凍融,。將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測,。
4. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復凍融,。
試劑盒組成 :
1、30倍濃縮洗滌液 20ml×1瓶 7 終止液 6ml×1瓶
2,、酶標試劑 6ml×1瓶 8 標準品（160pg/ml） 0.5ml×1瓶
3,、酶標包被板 12孔×8條 9 標準品稀釋液 1.5ml×1瓶
4、樣品稀釋液 6ml×1瓶 10 說明書 1份
5,、顯色劑A液 6ml×1瓶 11 封板膜 2張
6,、顯色劑B液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1個
試劑盒特點:
1、高效,、靈敏,、特異的抗體;
2、穩(wěn)定的重復性和可靠性;
3,、吸附性能好,，空白值低，孔底透明度高的固相載體;
4,、適用血清,、血漿、組織勻漿液,、細胞培養(yǎng)上清液,、尿液等等多種標本類型;
5、節(jié)省實驗經(jīng)費,。
操作步驟：
1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支,，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。
80pg/ml | 5號標準品 | 150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液 |
40pg/ml | 4號標準品 | 150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
20pg/ml | 3號標準品 | 150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
10pg/ml | 2號標準品 | 150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
5pg/ml | 1號標準品 | 150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑,，其余各步操作相同）,、標準孔、待測樣品孔,。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl,，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）,。加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。
4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去，如此重復5次,，拍干,。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl,，空白孔除外,。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5,。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色10分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測定：以空白孔調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。
操作程序總結(jié)：
計算：
以標準物的濃度為橫坐標,，OD值為縱坐標,，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。
注意事項：
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,，酶標包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。
2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果,。
3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器,，并經(jīng)常校對其準確性,，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi),，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標準曲線,，最好做復孔,。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定,，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染,。
6．底物請避光保存,。
7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8．所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。
9．本試劑不同批號組分不得混用。