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氧還原蛋白過氧化物酶4酶聯免疫試劑盒說明書

閱讀:93          發(fā)布時間:2021-12-22
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氧還原蛋白過氧化物酶4酶聯免疫試劑盒說明書

實驗原理:

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中血清素/血清胺(ST)水平。用純化的血清素/血清胺(ST)抗體包被微孔板,,制成固相抗體,,往包被單抗的微孔中依次加入血清素/血清胺(ST),再與HRP標記的血清素/血清胺(ST)抗體結合,,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,,經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色,,并在酸的作用下轉化成最終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的血清素/血清胺(ST)呈正相關,。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中血清素/血清胺(ST)濃度,。

特點:

1,、高效,、靈敏,、特異的抗體;

2、穩(wěn)定的重復性和可靠性;

3,、吸附性能好,,空白值低,孔底透明度高的固相載體;

4,、適用血清,、血漿、組織勻漿液,、細胞培養(yǎng)上清液,、尿液等等多種標本類型。

試劑盒性能:
1. 靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號標準品,。稀釋度的線性,。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。
2. 特異性:不與其它細胞因子反應,。
3. 重復性:板內,、板間變異系數均小于10%。

標本要求:

1.標本采集后盡早進行提取,,提取按相關文獻進行,,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,,可將標本放于-20℃保存,,但應避免反復凍融

2.不能檢測含NaN3的樣品,,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性,。

樣本處理及要求:
1.血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分),。仔細收集上清,,保存過程中如出現沉淀,應再次離心,。

2.血漿:應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分),。仔細收集上清,,保存過程中如有沉淀形成,,應該再次離心。

3.尿液:用無菌管收集,,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分),。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,,應再次離心,。胸腹水、腦脊液參照實行,。

4.細胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時,,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分),。仔細收集上清,。檢測細胞內的成份時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,,細胞濃度達到100萬/ml左右,。通過反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內成份,。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分),。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,,應再次離心,。

5.組織標本:切割標本后,稱取重量,。加入一定量的PBS,,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度,。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分,。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分),。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,,其余冷凍備用,。
標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,,提取后應盡快進行實驗,。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融,。

操作步驟:
1. 使用前,,將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫,,以免加樣時加入大量的氣泡,,產生加樣上的誤差。
2. 根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數,。每個標準品和空白孔建議做復孔,。每個樣品根據自己的數量來定,能使用復孔的盡量做復孔,。標本用標本稀釋液1:1稀釋后加入50ul于反應孔內,。
3. 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔,、加入待測樣品50ul于反應孔內,。立即加入50ul的生物su標記的抗體。蓋上膜板,,輕輕振蕩混勻,,37℃溫育1小時。
4. 甩去孔內液體,,每孔加滿洗滌液,,振蕩30秒,甩去洗滌液,,用吸水紙拍干,。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,,洗滌次數增加一次,。
5. 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,,37℃溫育30分鐘,。
6. 甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,,振蕩30秒,,甩去洗滌液,用吸水紙拍干,。重復此操作3次,。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次,。
7. 每孔加入底物A,、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘,。避免光照,。
8. 取出酶標板,迅速加入50ul終止液,,加入終止液后應立即測定結果,。
9. 在450nm波長處測定各孔的OD值。

            操作程序總結.png


結果判斷與分析:
1,、儀器值:于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2,、以吸光度OD值為縱坐標(Y),相應的ES標準品濃度為橫坐標(X),,做得相應的曲線,,樣品的ES含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

3,、檢測值范圍:0-240pg/ml

4,、敏感度: 0.1 pg/ml

操作注意事項:
1. 試劑應按標簽說明書儲存,使用前恢復到室溫,。稀稀過后的標準品應丟棄,,不可保存。
2. 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,,密封保存,,以免變質。
3. 不用的其它試劑應包裝好或蓋好,。不同批號的試劑不要混用,。保質前使用。
4. 使用一次性的吸頭以免交叉污染,,吸取終止液和底物A,、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器,。
5. 使用干凈的塑料容器配置洗滌液,。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6. 洗滌酶標板時應充分拍干,,不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水,。
7. 底物A應揮發(fā),避免長時間打開蓋子,。底物B對光敏感,,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,,有毒,。實驗完成后應立即讀取OD值,。
8. 加入試劑的順序應一致,以保證所有反應板孔溫育的時間一樣,。
9. 按照說明書中標明的時間,、加液的量及順序進行溫育操作。


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