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ELISA試劑盒在實(shí)驗中如何操作說明
閱讀：162 發(fā)布時間：2019-4-10| 提 供 商 | 上海撫生實(shí)業(yè)有限公司 | 資料大小 | 18KB |
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ELISA試劑盒在實(shí)驗中如何操作說明
的試劑,，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件,。ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異,，國內(nèi)醫(yī)學(xué)檢驗一般均用板式,。本文將敘述板式ELISA各個操作步驟的注意要點(diǎn)（珠式,、管式及磁性球ELSIA，國外試劑均與特殊儀器配合應(yīng)用,，兩者均有詳細(xì)的使用說明,，須嚴(yán)格遵照規(guī)程操作）。
標(biāo)本的采取和保存
通常我們可用于ELISA檢測的樣本是有多種類型的,，如血清,、血漿、尿液,、細(xì)胞培養(yǎng)上清或組織勻漿液等,，不同類型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。正確的處理樣本是保證ELISA檢測的正確性和準(zhǔn)確性的步,，下面簡單介紹一下不同類型的樣本的處理方法,。
血清
血清是常用于ELISA檢測的一類樣本，處理也比較簡單,。
用無熱原,、無內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液標(biāo)本，將試管或離心管室溫放置2小時或4℃過夜,，使血清析出,。（將試管或離心管傾斜放置,，使液面橫截面增大，能使血清更大程度的析出,。）4℃1000×g離心20min,，仔細(xì)收集上清。建議將血清分裝多份,，-20℃或-80℃保存,，避免反復(fù)凍融。
采血過程中應(yīng)避免溶血,，因為紅細(xì)胞裂解時會釋放具有過氧化酶活性的物質(zhì),，在以HRP為標(biāo)記的ELISA檢測中會有非特異性的顯色，而導(dǎo)致檢測的不準(zhǔn)確性,。同時也應(yīng)避免細(xì)菌污染,，因為菌體內(nèi)可能含有內(nèi)源性的HRP從而導(dǎo)致檢測的假陽性。
血漿
用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液標(biāo)本,，標(biāo)本采集后30min內(nèi)4℃1000×g離心15min,，取上清即血漿。將上清分裝多份,，-20℃或-80℃保存,，避免反復(fù)凍融。避免使用溶血或高血脂的標(biāo)本,。
常用的抗凝劑為EDTA,、肝素鈉和枸櫞酸鈉等，檢測時還應(yīng)仔細(xì)閱讀試劑盒說明書,，檢查試劑盒是否對抗凝劑有特殊要求,。
細(xì)胞培養(yǎng)上清
取細(xì)胞培養(yǎng)上清到離心管，1000×g離心20min,，除去細(xì)胞碎片及雜質(zhì),，取上清，-20℃或-80℃保存,，避免反復(fù)凍融,。
細(xì)胞裂解液
1) 吸去培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基，用胰酶消化細(xì)胞,，加適量培養(yǎng)基將細(xì)胞從培養(yǎng)板上吹下來,。懸浮細(xì)胞可省略。
2) 收集細(xì)胞懸液,，1000×g離心10min,，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS潤洗3次,。
3) 加入適量的預(yù)冷PBS或細(xì)胞裂解液（臨用前加入蛋白酶抑制劑）重懸細(xì)胞,。通常6孔板一個孔的細(xì)胞量需要150~250μL PBS重懸,。
4) 將樣品放入-20℃或-80℃，使樣品冷凍,，再放室溫解凍樣品,，反復(fù)凍融幾次，使細(xì)胞充分裂解,。也可將樣品進(jìn)行超聲破碎,，以達(dá)到裂解的目的。
5) 4℃10000×g 離心10min,，除去細(xì)胞碎片,，取上清，-20℃或-80℃保存,，避免反復(fù)凍融,。
組織勻漿液
1) 將組織樣本用PBS (0.01M, PH 7.4) 沖洗，洗去組織表面殘留的血液或雜質(zhì),。
2) 將組織塊稱重,，記錄后剪碎，碎塊應(yīng)盡量小,，便于勻漿得更充分。
3) 將組織按一定的比例加入預(yù)冷的PBS（臨用前加入蛋白酶抑制劑）勻漿,，勻漿時置于冰上或冰浴中,。（通常按組織重量：PBS體積=1:9的比例勻漿，例如1g的組織樣本對應(yīng)9mL的PBS,，具體體積可根據(jù)實(shí)驗需要適當(dāng)調(diào)整,，檢測后計算樣品濃度時應(yīng)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)）。
4) 吸取勻漿液到離心管,，4℃5000×g 離心5~10min,，取上清，-20℃或-80℃保存,，避免反復(fù)凍融,。
尿液、唾液等其他液體生物樣本
1000×g離心20min,，取上清即可檢測,。
總的來說，因為ELISA只能檢測可溶性蛋白的含量,，所以應(yīng)保證所有樣本均為澄清的液體,，沉淀或懸浮物都應(yīng)離心去除。
為了保證檢測的準(zhǔn)確性,，保存于-20℃或-80℃的樣本在1~6個月內(nèi)檢測,；4℃保存的樣本應(yīng)在1周內(nèi)進(jìn)行檢測,。
另外，還應(yīng)保證樣本不含NaN3,，因為NaN3會抑制HRP的活性,，從而導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。
試劑的準(zhǔn)備
按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實(shí)驗中需用的試劑,。ELISA中用的蒸餾水或去離子水,，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的,。自配的緩沖液,、洗滌液應(yīng)用pH計測量。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用,，一般室溫平衡不低于30min,。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存。
加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚,，即加標(biāo)本,，加酶結(jié)合物，加底物,。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部,，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出,，不可產(chǎn)生氣泡,。
加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中,。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴,，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣（一般不建議使用）,。有些指標(biāo)檢測（如間接法ELISA）需用稀釋的血清,，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液,，再在其中加入血清標(biāo)本,，然后在微型震蕩器上震蕩1min。加酶結(jié)合物工作液和底物工作液時可用多道移液器,，使加液過程在短時間內(nèi)完成,。