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聚合酶鏈式反應(PCR)影響因素介紹
閱讀：233 發(fā)布時間：2025-2-18PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶鏈式反應，可以選擇性擴增一段DNA序列。其基本步驟是,，首先將待擴增的模板DNA變性使之成為單鏈，DNA樣品中,，特異性的引物能夠與其互補的序列雜交,，在dNTPs和Taq酶存在時，就可以合成模板DNA的互補鏈,，反應完成后,，將反應混合物加熱使DNA雙鏈變性,，溫度下降后，過量的引物又可以開始第二輪的合成反應,。這種延伸-變性-退火-延伸的循環(huán)可以重復多次,，使所需要的DNA片段得到特異性的擴增。
1. 變性：加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變性,，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈,。
2. 退火：使溶液溫度降至50～60℃，模板DNA與引物按堿基配對原則互補結合,。
3. 延伸：溶液反應溫度升至72℃,，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導下,，利用反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）,，按5ˊ→3ˊ方向復制出互補DNA。
上述3步為一個循環(huán),，即高溫變性,、低溫退火、中溫延伸3個階段,。從理論上講,，每經過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應該增加一倍,，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板,，經過25～30個循環(huán)后DNA可擴增106～109倍。
影響PCR 反應結果因素：
1,、引物：
引物是PCR特異性反應的關鍵,，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。
設計引物應遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp,，常用為20bp左右,。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段,。
③引物堿基：G+C 含量以40-60%為宜,，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC最好隨機分布，避免5 個以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列,。
④避免引物內部出現(xiàn)二級結構,，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補,，否則會形成引物二聚體,，產生非特異的擴增條帶,。
⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基,，應嚴格要求配對,，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點,， 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點,， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性,。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol,，以低引物 量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,，且可增加引物之間形成二聚體的機會,。
2、酶及其濃度
目前有兩種Taq DNA聚合酶供應,， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時),，濃度過高可引起非特異性擴增,，濃度過低則合成產物量減少。
3,、dNTP的質量與濃度
dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系,，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性,。dNTP溶液呈酸性,，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris.HCL的緩沖液將其 PH調節(jié)到7.0～7.5,，小量分裝,， -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解,。在PCR反應中,，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制),，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量,。dNTP能與Mg2+結合,，使游離的Mg2+濃度降低。
4,、模板(靶基因)核酸
模板核酸的量與純化程度,，是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一,，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K 來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質,，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜,，并解離細胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質結合而沉淀,； 蛋白酶K 能水解消化蛋白質,，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與lv 仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份,，用乙醇或異丙醇沉淀核酸,。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本,，可采用快速簡便的方法溶解細胞,，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離,，直接用于PCR擴增,。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K 法，要防止RNase降解RNA,。
5,、Mg2+濃度
Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中,，各種dNTP濃度為200umol/L時,，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高,，反應特異性降低,，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,，使反應產物減少,。
6、溫度與時間的設置：
基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點,。在標準反應中采用三溫度點法,，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃,，引物退火并結合到靶序列上,，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下,，使引物鏈沿模板延伸,。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法， 除變性溫度外,、退火與延伸溫度可合二為一,，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性),。
①變性溫度與時間：
變性溫度低,，解鏈不全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下,，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性,，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高,，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響,。此步若不能使靶基因模板或PCR產物全變性，就會導致PCR失敗,。
②退火(復性)溫度與時間：
退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素,。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結合,。由于模板DNA 比引物復雜得多,，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間,，取決于引物的長度,、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度,。對于20 個核苷酸,，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想,。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復性溫度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允許范圍內,， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性,。復性時間一般為30～60sec,，足以使引物與模板之間全結合。
③延伸溫度與時間：
Taq DNA聚合酶的生物學活性：
70～80℃ 150 核苷酸/S/酶分子
70℃ 60 核苷酸/S/酶分子
55℃ 24 核苷酸/S/酶分子
高于90℃時,， DNA 合成幾乎不能進行,。
PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃,，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合,。PCR延伸反應的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定,，一般1Kb以內的DNA片段,，延伸時間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min,；擴增10Kb 需延伸至15min,。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn),。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些,。
7,、循環(huán)次數(shù)
循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度,。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間,，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產物的量亦隨之增多,。