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實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法原理簡述
閱讀：46 發(fā)布時(shí)間：2025-1-14目前主流的實(shí)時(shí)熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）方法分為染料法和探針法,，染料法以SYBR Green法為代表,，SYBR Green染料游離時(shí)熒光微弱，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后,，熒光大大增強(qiáng),，反應(yīng)管中的熒光強(qiáng)度與反應(yīng)管中雙鏈DNA的數(shù)量成正比例關(guān)系，因此可以通過檢測熒光計(jì)算反應(yīng)管中產(chǎn)生的雙鏈DNA（PCR產(chǎn)物）的量,，但該方法沒有特異性,，非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)物也會(huì)被計(jì)入。對于探針法來說,，反應(yīng)管中的熒光強(qiáng)度也是檢測PCR產(chǎn)物量的依據(jù),。但其發(fā)光機(jī)制卻與染料法全不同。
根據(jù)所使用的技術(shù)不同,，實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以分為：熒光探針和熒光染料兩種方法?，F(xiàn)將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針
TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術(shù)，其核心是利用Taq酶的3'→5'外切核酸酶活性,，切斷探針,，產(chǎn)生熒光信號。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,，該探針為一寡核苷酸,，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí),，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收,；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的3'→5'外切酶活性將探針酶切降解,，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈,，就有一個(gè)熒光分子形成,，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成wan全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析,，又可分析基因突變（SNP）,，有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的shou選技術(shù)平臺。
2. SYBR熒光染料
在PCR反應(yīng)體系中,，加入過量SYBR熒光染料,，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號,，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號,，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加wan全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合,，因此可以通過溶解曲線,，確定PCR反應(yīng)是否特異。SYBR熒光染料法定量PCR的基本過程是：
① 開始反應(yīng),，當(dāng)SYBR染料與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光,；
② DNA變性時(shí)，SYBR染料釋放出來,，熒光急劇減少,；
③ 在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR引物,；
④ 聚合完成后,，SYBR染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大,。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)根據(jù)化學(xué)原理可以分為探針類和非探針類,。探針類實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)主要是利用與靶序列特異雜 交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加；非探針類實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技 術(shù)主要通過熒光染料來指示產(chǎn)物的增加,。無論是探針類實(shí)時(shí)熒光 定量 PCR 技術(shù)還是非探針類實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù),，檢測的都是 擴(kuò)增產(chǎn)物的增加量。但探針類實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)增加了識別 探針的具體的流程,，操作的難度較大,。