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酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）實驗各封閉劑優(yōu)缺點
閱讀：151 發(fā)布時間：2024-11-25酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay,，ELISA）是免疫學(xué)和分子生物學(xué)中廣泛使用的實驗室技術(shù),，是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識別和結(jié)合原理,，對待測抗體或者抗原進行分析測定的方法,。封閉（blocking）是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程,?？乖蚩贵w包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙,，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙,，從而排斥在ELISA試劑盒其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。在免疫學(xué)實驗中,，通常使用封閉劑來減少非特異性結(jié)合,。常用的封閉劑有脫脂奶粉，BSA,，血清以及 Fab 片段單鏈二抗等,。根據(jù)不同的平臺選擇相應(yīng)的封閉劑。
1,、脫脂奶粉
作用原理：脫脂奶粉含有多種蛋白,，可以封閉未吸附蛋白的固相載體（WB 膜、ELISA 板等）位點,，減少抗體與之結(jié)合的概率,，避免非特異性結(jié)合帶來的高背景。
優(yōu)點：價格便宜,，因含多種不同分子量的蛋白,，故封閉起來更全面。
缺點：成分復(fù)雜,，適用范圍窄,。不適用于生物素和堿性磷酸酶標記的抗體系統(tǒng)。且封閉后的載體不易長期保存,，因此在試劑盒的生產(chǎn)中較少應(yīng)用,。
2、牛血清白蛋白BSA
作用原理：同脫脂奶粉,，封閉未吸附蛋白的固相載體位點,。
優(yōu)點：成分單一，適用于 ELISA 實驗,，生物素,、堿性磷酸酶系統(tǒng)的免疫學(xué)檢測實驗或者其他對特異性要求較高的實驗。
缺點：大部分 BSA 中有少量的抗體殘留，會導(dǎo)致抗原/抗體之間的交叉反應(yīng),，造成一定背景,。
3、動物血清
作用原理：
1,、待檢樣本會有些與蛋白非特異性結(jié)合的物質(zhì),，從而導(dǎo)致背景過高，因此可以用血清封閉掉這部分非特異性的結(jié)合,，從這點看,，血清和 BSA 沒有明顯區(qū)別；
2,、待檢樣本中可能會有 Fc 受體,，可以和抗體恒定區(qū)結(jié)合，而封閉血清中有抗體,，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本 Fc 受體之間結(jié)合,。BSA 則無法封閉 Fc 受體。
優(yōu)點：因為血清可以封閉 Fc 受體及減少抗體間的非特異性結(jié)合,，故在免疫組化,、免疫熒光實驗中有廣泛應(yīng)用。
缺點：某些封閉血清中可能含有疊氮鈉,，因此不適用于 HRP 酶標的檢測體系,。
4、Fab 片段單鏈二抗
作用原理：由于二價的抗體（全 IgG 或 F（ab’）2 片段）有兩個結(jié)合位點,，不能用來封閉。而 Fab 片段單鏈二抗只有一個結(jié)合位點,，因此可全封閉免疫球蛋白,。
應(yīng)用：在 IHC 或 IF 雙標/多標實驗中，封閉樣本表面的免疫球蛋白,，封閉組織切片或細胞表面的內(nèi)源性免疫球蛋白,，并可解決兩個一抗來自同一種屬的麻煩。
5,、無蛋白封閉劑---新型高效封閉劑
Blocker 無蛋白封閉劑,，該封閉劑是通過化學(xué)合成高親水性化合物，不存在生物封閉劑所擔(dān)心的生物安全性,、質(zhì)量,、批間差等問題。
主要特點：
1）與微球表面活化的羧基偶聯(lián)形成穩(wěn)定的共價鍵
2）純化學(xué)合成,，批間差小,，純度高
3）空間結(jié)構(gòu)簡單，更充分的封閉微球表面，降低微球非特異性吸附,，減少基質(zhì)干擾
4）提高試劑靈敏度
5）含大量親水基團,，有利于提高試劑穩(wěn)定性
應(yīng)用領(lǐng)域：乳膠免疫比濁試劑/ 化學(xué)發(fā)光試劑 ，代替 BSA 作為封閉劑或與 BSA 聯(lián)合封閉,。
6,、免疫試劑穩(wěn)定液
免疫試劑穩(wěn)定液主要用于免疫分析檢測試劑/抗原/抗體/蛋白的保存. 該產(chǎn)品屬于即用型，無需稀釋,，使用簡單方便,，將待保存物質(zhì)溶于穩(wěn)定液中后置于冰箱即可。免疫試劑穩(wěn)定 液有利于維持蛋白的三維結(jié)構(gòu),，保持蛋白的生物活性,，可延長免疫分析試劑及蛋白的使用期限，確保產(chǎn)品的性能,。
應(yīng)用領(lǐng)域:
1）免疫分析試劑保存, 如免疫比濁檢測試劑/化學(xué)發(fā)光檢測試劑
2）蛋白質(zhì)保存,，如抗原/抗體/酶類等