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    最好是用淋巴細胞分離液把單個核細胞分離出來,，然后-80℃保存,。外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）的分離是免疫學研究中的一項基本技術(shù)。目前國內(nèi)外分離PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法（ficoll-hypaque density gradient centrifugation）,，用此方法分離PBMC純度可達95％,，淋巴細胞約占90％，其中T淋巴細胞占80％,，B淋巴細胞占4～10％,。ficoll-hypaque混合溶液，又稱淋巴細胞分層液,，在分離人PBMC時,，要求其比重為1.077；分離小鼠單個核細胞時比重為1.080,；分離大鼠單個核細胞時比重為1.084～1.087,；分離馬單個核細胞時比重為1.090。

原理 ：

血液中各有形成分的比重存在差異,，利用比重為1.077,、近于等滲的ficoll-hypaque混合溶液（又稱淋巴細胞分層液）作密度梯度離心時，各種血液成分將按密度梯度重新聚集,。血漿和血小板由于密度較低,，故懸浮于分層液的上部,；紅細胞與粒細胞由于密度較大,，故沉于分層液的底部；PBMC密度稍低于分層液,，故位于分層液界面上，這樣就可獲得PBMC,。

 方法：

1.靜脈取血2ml，加入含肝素溶液(10～50u／m1血樣本)的試管中,，混勻，使血液抗

凝,。用pH7.2 Hanks液將抗凝血稀釋1倍。

2.吸取2ml淋巴細胞分層液置于刻度離心管中,，然后將離心管傾斜45O角,，用毛細滴管將稀釋的全血沿管壁緩慢加至分離液上面,，應注意保持兩者界面清晰。

3.在18℃～20℃下,，用水平離心機以2000r/min離心20min,。離心后細胞分布如圖。

 4.用毛細吸管輕輕插到混濁帶,，沿管壁輕輕吸出此層細胞，移入另一支離心管中,。即要吸取所有單個核細胞,，又要避免吸取過多的分層液或血漿,，以免混入其他細胞成分,。

5.用Hanks液洗滌細胞3次,。第一次2000r/min ，10 min,；第2～3 次1500r/min ,，10 min,，可去掉大部分混雜的血小板。

6.將沉淀細胞懸于培養(yǎng)基中備用,。

注意事項：

  1,、實驗所用玻璃器皿應該潔凈。如果制備的單個核細胞懸液用于細胞培養(yǎng)時,，上述操作過程都要在無菌條件下進行,，所用器材、試劑都應為無菌,。

 2,、實驗中的細胞得率與室溫及分層液比重等有關(guān)。分層液應避光4℃保存,。

3,、往淋巴細胞分層液中加入稀釋全血時，不得將血液沖入分離液中,，須保持兩層液體的清晰界面,。