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逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)條件選擇指南
閱讀：94 發(fā)布時間：2024-4-16 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細胞中的總RNA,，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增,，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級,，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能,。
該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因,、合成cDNA探針,、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。
一,、反轉(zhuǎn)錄酶的選擇
1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強的聚合酶活性,，RNA酶H活性相對較弱,。最適作用溫度為37℃。
2．禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強的聚合酶活性和RNA酶H活性,。最適作用溫度為42℃,。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn2+存在下,，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA,，以消除RNA模板的二級結(jié)構(gòu)。
4．MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H-突變體：商品名為Superscript 和SuperScriptⅡ,。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA,，這一特性允許從含二級結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA,。
二,、合成cDNA引物的選擇
1． 隨機六聚體引物：當(dāng)特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA,。用此種方法時,，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性,。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA,。
2． Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾,，此引物與其配對,，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%,，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小,。
3． 特異性引物：最特異的引發(fā)方法是用含目標(biāo)RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應(yīng)用二種特異性引物,，第一條鏈的合成可由與mRNA 3’端最靠近的配對引物起始,。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴增,。