化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
ELISA檢測法結(jié)果判斷方法詮釋
閱讀：129 發(fā)布時間：2024-3-25ELISA定性測定的結(jié)果判斷是對受檢標(biāo)本中是否含有待測抗原或抗體作出 "有"或"無"的簡單回答,，分別用"陽性",、"陰性"表示,。"陽性"表示該標(biāo)本在該測定系統(tǒng)中有反應(yīng),。"陰性"則為無反應(yīng),。用定性判斷法也可得到半定量結(jié)果，即用滴度來表示反應(yīng)的強(qiáng)度,，其實質(zhì)仍是一個定性試驗,。在這種半定量測定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗,，呈陽性反應(yīng)的稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低,，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱,，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽性、弱陽性具定量意義,。在間接法和夾心法 ELSIA中,，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反,，陰性孔呈色深于陽性孔,。兩類反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同，分述如下,。
1,、 間接法和夾心法
這類反應(yīng)的定性結(jié)果可以用肉眼判斷。目視標(biāo)本也無色或近于無色者判為陰性,，顯色清晰者為陽性,。但在 ELSIA中，正常人血清反應(yīng)后?？沙霈F(xiàn)呈色的本底,，此本底的深淺因試劑的組成和實驗的條件不同而異，因此實驗中必須加測陰性對照,。陰性對照的組成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物,。在用肉眼判斷結(jié)果時，宜用顯色深于陰性對照作為標(biāo)本陽性的指標(biāo)。目視法簡捷明了,，但頗具主觀性,。在條件許可下，應(yīng)該用比色計測定吸光值,，這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù),。先讀出標(biāo)本（sample，S）,、陽性對照（P）,、和陰性對照（N）的吸光值，然后進(jìn)行計算,。計算方法有多種,，大致可分為陽性判定值法和標(biāo)本與陰性對照比值法兩類。
a. 陽性判定值
陽性判定值（cut-off value）一般為陰性對照A值加上一個特定的常數(shù),，以此作為判斷結(jié)果陽性或陰性的標(biāo)準(zhǔn),。
用此法判斷結(jié)果要求實驗條件十分恒定，試劑的制備必須標(biāo)準(zhǔn)化,，陽性和陰性的對照品應(yīng)符合一定的規(guī)格,，須配用的儀器，并嚴(yán)格按規(guī)定操作,。陽性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過對大量標(biāo)本的實驗檢測而得到的?，F(xiàn)舉某種檢測 HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復(fù)鈣人血漿,，陽性對照品HBsAg的含量標(biāo)明為P=9±2ng /ml,。每次試驗設(shè)2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值后,，先計算陰性對照A值的平均數(shù)（NC X ）和陽性對照A值的平均數(shù)（PCX）,，兩個平均數(shù)的差（P-N）必須大于一個特定的數(shù)值（例0.400），試驗才有效,。3個陰性對照A值均應(yīng)≥0.5×NCX,，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍,，則棄去,，而已另兩個陰性對照重新計算NCX；如有兩個陰性對照A值超出以上范圍,，則該次實驗無效,。陽性判定值按下式計算：
陽性判定值=NCX+0.05
標(biāo)本 A值＞陽性判定值的為陽性，小于陽性判定值的為陰性,。應(yīng)注意的是,，式中0.05為該試劑盒的常數(shù),，只適合于該特定條件下，而不是對各種試劑均可通用,。
根據(jù)以上敘述可以看出,，在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到試驗的質(zhì)控作用，試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會產(chǎn)生"試驗無效"的后果,。
b. 標(biāo)本/陰性對照比值
在實驗條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下,，這種判斷法較為合適。在得出標(biāo)本（ S）和陰性對照（N）的A值后,，計算S/N值,。也有寫作P/N的，這里的P不代表陽性(positive),，而是病人（patient）的縮寫,，不應(yīng)誤解。為避免混淆,，宜用S/N表示,。在早期的間接法ELISA中，有些作者定出S/N為陽性標(biāo)準(zhǔn),，現(xiàn)多為各種測定所沿用,。實際上每一測定系統(tǒng)應(yīng)該用實驗求出各自的S/N的閾值。應(yīng)注意的是,，N所代表的陰性對照是不含受檢物質(zhì)的人血清,。有的試劑盒中所設(shè)陰性對照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液，以致反應(yīng)后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多,。因此，這類試劑盒規(guī),，如N<0.05（或其他數(shù)值）,，則按0.05計算，否則將出現(xiàn)假陽性結(jié)果,。
2,、 競爭法
在競爭法 ELISA中，陰性孔呈色深于陽性孔,。陰性呈色的強(qiáng)度取決于反應(yīng)中酶結(jié)合物的濃度和加入競爭抑制物的量,，一般調(diào)節(jié)陰性對照的吸光度在1.0-1.5之間，此時反應(yīng)為敏感,。
競爭法 ELISA不易用自視判斷結(jié)果,，因肉眼很難辨別弱陽性反應(yīng)與陰性對照的顯色差異，一般均用比色計測定,，讀出S,、P和N的吸光值。計算方法主要也有兩種，即陽性判定值法和抑制率法,。
a. 陽性判定值法
與間接法和夾心法中的陽性判定值法基本相同,，但在計算公式中引入陽性對照 A值，現(xiàn)舉某種檢測抗HBc的試劑盒為例,。試劑盒中的陰性對照為不含抗HBc的復(fù)鈣人血漿,，陽性對照中抗HBc含量為125±1 00u/ml。每次試驗設(shè)2個陽性對照和3個陰性對照,。測得A值后,，先計算陰性對照A值的平均值（NC X ）和陽性對照A值的平均數(shù)（PCX），兩個平均數(shù)的差（N-P）必須大于一個特定的數(shù)值（例如0.300）,試驗才有效,。3個陰性對照A值均應(yīng)小于2.000,，而且應(yīng)≥0.5×NCX并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍,，則棄去,，而以另2個陰性對照重新計算×NCX；如有2個陰性對照A超出以上范圍,，則該次實驗無效,。陽性判定值按下式計算：
陽性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX
標(biāo)本A值≤陽性判定值的反應(yīng)為陽性，A＞陽性判定值的反應(yīng)為陰性,。
b. 抑制率法
抑制率表示標(biāo)本在競爭結(jié)合中標(biāo)本對陰性反應(yīng)顯色的抑制程度,，按下式計算：
抑制率（%）= （陰性對照A值-標(biāo)本A值）×/陰性對照A值
一般規(guī)定抑制率≥50%為陽性，＜50%為陰性,。