化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
ELISA定性測定結(jié)果判斷方法介紹
閱讀：124 發(fā)布時間：2024-3-11ELISA定性測定的結(jié)果判斷是對受檢標本中是否含有待測抗原或抗體作出 "有"或"無"的簡單回答，分別用"陽性",、"陰性"表示。"陽性"表示該標本在該測定系統(tǒng)中有反應(yīng),。"陰性"則為無反應(yīng),。用定性判斷法也可得到半定量結(jié)果，即用滴度來表示反應(yīng)的強度,，其實質(zhì)仍是一個定性試驗,。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進行試驗,，呈陽性反應(yīng)的稀釋度即為滴度,。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標本反應(yīng)性的強弱,，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性,、弱陽性具定量意義。在間接法和夾心法 ELSIA中,，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反,，陰性孔呈色深于陽性孔,。兩類反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同，介紹如下：
1,、 間接法和夾心法
這類反應(yīng)的定性結(jié)果可以用肉眼判斷,。目視標本也無色或近于無色者判為陰性，顯色清晰者為陽性,。但在 ELSIA中,，正常人血清反應(yīng)后常可出現(xiàn)呈色的本底,，此本底的深淺因試劑的組成和實驗的條件不同而異,，因此實驗中必須加測陰性對照,。陰性對照的組成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物。在用肉眼判斷結(jié)果時,，宜用顯色深于陰性對照作為標本陽性的指標,。目視法簡捷明了，但頗具主觀性,。在條件許可下,，應(yīng)該用比色計測定吸光值，這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù),。先讀出標本（sample,，S）、陽性對照（P）,、和陰性對照（N）的吸光值,，然后進行計算。計算方法有多種,，大致可分為陽性判定值法和標本與陰性對照比值法兩類,。
a. 陽性判定值
陽性判定值（cut-off value）一般為陰性對照A值加上一個特定的常數(shù)，以此作為判斷結(jié)果陽性或陰性的標準,。
用此法判斷結(jié)果要求實驗條件十分恒定,，試劑的制備必須標準化，陽性和陰性的對照品應(yīng)符合一定的規(guī)格,，須配用的儀器,，并嚴格按規(guī)定操作。陽性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過對大量標本的實驗檢測而得到的?，F(xiàn)舉某種檢測 HBsAg的試劑盒為例,。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復(fù)鈣人血漿，陽性對照品HBsAg的含量標明為P=9±2ng /ml,。每次試驗設(shè)2個陽性對照和3個陰性對照,。測得A值后，先計算陰性對照A值的平均數(shù)（NC X ）和陽性對照A值的平均數(shù)（PCX）,，兩個平均數(shù)的差（P-N）必須大于一個特定的數(shù)值（例0.400）,，試驗才有效。3個陰性對照A值均應(yīng)≥0.5×NCX,，并≤1.5×NCX,，如其中之一超出此范圍，則棄去,，而已另兩個陰性對照重新計算NCX,；如有兩個陰性對照A值超出以上范圍，則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算：
陽性判定值=NCX+0.05
標本 A值＞陽性判定值的為陽性,，小于陽性判定值的為陰性,。應(yīng)注意的是，式中0.05為該試劑盒的常數(shù),，只適合于該特定條件下,，而不是對各種試劑均可通用。
根據(jù)以上敘述可以看出,，在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到試驗的質(zhì)控作用,，試劑變質(zhì)和操作不當均會產(chǎn)生"試驗無效"的后果。
b. 標本/陰性對照比值
在實驗條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下,，這種判斷法較為合適,。在得出標本（ S）和陰性對照（N）的A值后，計算S/N值,。也有寫作P/N的,，這里的P不代表陽性(positive)，而是病人（patient）的縮寫,，不應(yīng)誤解,。為避免混淆，宜用S/N表示,。在早期的間接法ELISA中,，有些作者定出S/N為陽性標準，現(xiàn)多為各種測定所沿用,。實際上每一測定系統(tǒng)應(yīng)該用實驗求出各自的S/N的閾值,。應(yīng)注意的是，N所代表的陰性對照是不含受檢物質(zhì)的人血清,。有的試劑盒中所設(shè)陰性對照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液,，以致反應(yīng)后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此,，這類試劑盒規(guī),，如N<0.05（或其他數(shù)值），則按0.05計算,，否則將出現(xiàn)假陽性結(jié)果,。
2、 競爭法
在競爭法 ELISA中,，陰性孔呈色深于陽性孔。陰性呈色的強度取決于反應(yīng)中酶結(jié)合物的濃度和加入競爭抑制物的量,，一般調(diào)節(jié)陰性對照的吸光度在1.0-1.5之間,，此時反應(yīng)為敏感。
競爭法 ELISA不易用自視判斷結(jié)果,，因肉眼很難辨別弱陽性反應(yīng)與陰性對照的顯色差異,，一般均用比色計測定,，讀出S、P和N的吸光值,。計算方法主要也有兩種,，即陽性判定值法和抑制率法。
a. 陽性判定值法
與間接法和夾心法中的陽性判定值法基本相同,，但在計算公式中引入陽性對照 A值,，現(xiàn)舉某種檢測抗HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照為不含抗HBc的復(fù)鈣人血漿,，陽性對照中抗HBc含量為125±1 00u/ml,。每次試驗設(shè)2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值后,，先計算陰性對照A值的平均值（NC X ）和陽性對照A值的平均數(shù)（PCX）,，兩個平均數(shù)的差（N-P）必須大于一個特定的數(shù)值（例如0.300）,試驗才有效。3個陰性對照A值均應(yīng)小于2.000,，而且應(yīng)≥0.5×NCX并≤1.5×NCX,，如其中之一超出此范圍，則棄去,，而以另2個陰性對照重新計算×NCX,；如有2個陰性對照A超出以上范圍，則該次實驗無效,。陽性判定值按下式計算：
陽性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX
標本A值≤陽性判定值的反應(yīng)為陽性,，A＞陽性判定值的反應(yīng)為陰性。
b. 抑制率法
抑制率表示標本在競爭結(jié)合中標本對陰性反應(yīng)顯色的抑制程度,，按下式計算：
抑制率（%）= （陰性對照A值-標本A值）×/陰性對照A值
一般規(guī)定抑制率≥50%為陽性,，＜50%為陰性。