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介紹酶解聚方法獲得純化的原代細(xì)胞
閱讀：134 發(fā)布時(shí)間：2024-2-5原代細(xì)胞分離的方法有多種,，常用的是機(jī)械解離細(xì)胞法,、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法，下面我們就介紹酶解聚方法獲得純化的原代細(xì)胞,。
1、胰蛋白酶 純化法
●在去除不需要的組織后,，使用無(wú)菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4 mm小片,，通過(guò)懸浮在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀,，去除上清液,。重復(fù)清洗2到3次,。
●將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液,。加入0.25%溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（100 mg組織加入1ml 胰蛋白酶）,。
●在4℃孵育6到18小時(shí)，使幾乎沒(méi)有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進(jìn)去,。
●移棄組織碎片中的胰蛋白酶,，在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘。
●在組織碎片加入熱的全培養(yǎng)基,，用移液管輕輕地分散組織,。如果使用無(wú)血清培養(yǎng)基，要加入大豆胰蛋白酶抑制劑,。
●通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)（100～200 mm）過(guò)濾,，分散所有剩余組織。計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞,，進(jìn)行培養(yǎng),。
2、膠原酶純化法
●用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片,，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次,。
●加入膠原酶（50～200單位/ml，溶解在HBSS中）,。
●在37℃孵育4到18小時(shí),。加入3mM CaCl2增加解離效率。
●通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液,，以分離分散細(xì)胞,、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚,，在碎片中加入新鮮的膠原酶,。
●通過(guò)離心在HBSS中清洗懸液幾次。
●再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞,，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞,，進(jìn)行培養(yǎng)。
3,、Dispase純化法
●用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片,，用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。
●加入Dispase（0.6～2.4單位/ml 溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液）
●在37℃孵育20分鐘到幾個(gè)小時(shí),。
●通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液,，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚,，在碎片中加入新鮮的Dispase,。
●通過(guò)離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。
分離細(xì)胞后,，第一次傳代需要注意的問(wèn)題：
●傳代培養(yǎng)時(shí)先觀察細(xì)胞的活性,。
●細(xì)胞的活率應(yīng)該超過(guò)90%，密度控制在80%左右最佳
●對(duì)于無(wú)血清培養(yǎng)基,，需要降低胰蛋白酶使用量,。