化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
資訊推送：細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)必看
閱讀：156 發(fā)布時(shí)間：2024-1-15細(xì)胞凍存的必要性：
首先,，細(xì)胞培養(yǎng)過程中,，考慮到細(xì)胞株傳代次數(shù)逐漸增加后，細(xì)胞變異的可能性將增大,，繼續(xù)培養(yǎng)的話細(xì)胞株可能會(huì)出現(xiàn)老化,、狀態(tài)下降、丟失一些該細(xì)胞的特性的現(xiàn)象,，對后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成影響,；
此外，如果該細(xì)胞株特別珍貴,，屬于實(shí)驗(yàn)室重要資源,，對細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模的保存，能有效降低課題項(xiàng)目執(zhí)行的風(fēng)險(xiǎn);
最后,，就是常見的風(fēng)險(xiǎn)規(guī)避問題,，正所謂人有失手、馬有失蹄,，再熟練的實(shí)驗(yàn)操作者,、再厲害的實(shí)驗(yàn)設(shè)備也是有出問題的可能，一旦出問題,，意味著細(xì)胞資源的損失,。
基于以上幾點(diǎn)，細(xì)胞凍存對于一個(gè)實(shí)驗(yàn)室或個(gè)人來說,，是非常必要的操作,。
實(shí)驗(yàn)原理：
隨著溫度降低，細(xì)胞內(nèi)的酶活性會(huì)逐漸降低,，到-70℃左右,，酶活性幾乎為0,，代謝活動(dòng)停止，可以實(shí)現(xiàn)長期保存,。然而,，隨著溫度降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分也會(huì)“結(jié)冰"并形成冰晶,，冰晶能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷,、電解質(zhì)升高、滲透壓改變,、脫水,、pH改變、蛋白變性等,，能引起細(xì)胞死亡,。因此常加入冷凍保護(hù)劑甘油或二甲基亞砜（DMSO）。DMSO能快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,，降低冰點(diǎn),，延緩凍存過程，同時(shí)增加細(xì)胞膜的通透性,，提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度,，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的,。
儀器和試劑：
1. 儀器：細(xì)胞計(jì)數(shù)儀,、臺(tái)式離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱,、倒置顯微鏡,、移液槍,、移液管移液器,、4℃和-20℃冰箱、-80℃超低溫冰箱,、程序降溫盒,、標(biāo)簽打印機(jī)、凍存管,、液氮罐
2. 試劑：基礎(chǔ)培養(yǎng)基,、FBS、PBS,、DMSO,、胰酶
實(shí)驗(yàn)步驟：
1. 制備凍存液，凍存液比例：本實(shí)驗(yàn)室采用70%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO,，不同實(shí)驗(yàn)室及不同細(xì)胞可能略有差異,，也可采用55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%FBS+5%DMSO,；
2. 取形態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的細(xì)胞,，對其消化,、離心 (1500rpm離心8min)、計(jì)數(shù),；
3. 根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入對應(yīng)的凍存液,，使細(xì)胞密度維持在300-500w/mL；
4. 小心用鑷子打開凍存管管蓋,，每管分裝1-1.5mL含細(xì)胞的凍存液,，擰緊蓋管，做好標(biāo)記,。
5. 分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒后直接放-80℃過夜,；
6. 若沒有程序降溫盒，則按下列順序依次降溫：室溫→4℃20min→-20℃30min→-80℃過夜,，注意轉(zhuǎn)移過程中要保冷,，避免產(chǎn)生溫差或凍存管融化；
7. 從-80℃冰箱取出凍存管迅速轉(zhuǎn)移到液氮長期保存,。
注意事項(xiàng)：
1. 細(xì)胞凍存原則為“慢凍",，即讓細(xì)胞在緩慢降溫的條件下逐漸冷凍。當(dāng)細(xì)胞快速冷凍時(shí),，水和離子往往會(huì)留在細(xì)胞中,，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成會(huì)撕裂和刺穿細(xì)胞膜。相反,，如果細(xì)胞冷凍太過緩慢,，則細(xì)胞外的水會(huì)在細(xì)胞內(nèi)冰形成之前結(jié)冰。這允許水通過滲透作用逸出,，但增加了可能有毒的細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度,。因此對于大多數(shù)細(xì)胞，最佳冷凍速率在每分鐘1℃之間,。
2. DMSO能夠快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中,，延緩溫度下降速度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用,。
3. 凍存可用10%～90%的血清，一般高濃度血清有助于維護(hù)細(xì)胞活力,，此處介紹20%終濃度有利于細(xì)胞懸浮而少沉積(4℃時(shí)),，復(fù)蘇存活率在80%～90%，對原代培養(yǎng)細(xì)胞,，以90%血清凍存更為有效,。
4. 細(xì)胞離心后盡量吸干凈上清液,，減少培養(yǎng)基殘留，避免稀釋凍存液,。
5. DMSO溶于培養(yǎng)基時(shí),，將釋放大量熱量，所以細(xì)胞凍存液需提前配制,，冷卻后再使用,，不能直接將DMSO加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，避免燙傷細(xì)胞,。
6. 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇過程中,，不可避免會(huì)損失部分細(xì)胞，所以凍存的密度不能太低,。推薦密度為300-500w/mL,。
7. 細(xì)胞懸液加入凍存液以后盡量短時(shí)間的在常溫放置，DMSO常溫下對細(xì)胞損傷大,，分裝完成后立即轉(zhuǎn)入程序降溫盒,。