化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
原代細(xì)胞培養(yǎng)具體方法步驟敘述
閱讀：162 發(fā)布時間：2024-1-8一、準(zhǔn)備工作
準(zhǔn)備工作對開展細(xì)胞培養(yǎng)異常重要,，工作量也較大,，應(yīng)給予足夠的重視，推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實驗失敗或無法進行,。準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗,、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制,、分裝及滅菌,，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試，具體內(nèi)容可參閱有關(guān)文獻,。
二,、取材
在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細(xì)胞（視實驗?zāi)康亩ǎ?jīng)過一定的處理（如消化分散細(xì)胞,、分離等）后接入培養(yǎng)器血中,，這一過程稱為取材。如是細(xì)胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程,。機體取出的組織細(xì)胞的首ci 培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng),。
理論上講各種動物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養(yǎng),，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng),，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。取材后應(yīng)立即處理,，盡快培養(yǎng),，因故不能馬上培養(yǎng)時，可將組織塊切成黃豆般大的小塊,，置4℃的培養(yǎng)液中保存,。取組織時應(yīng)嚴(yán)格保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質(zhì),。取病理組織和皮膚及消化道上皮細(xì)胞時容易帶菌,，為減少污染可用抗菌素處理。
由組織并分離分散細(xì)胞的方法可參閱有關(guān)文獻,。
三,、培養(yǎng)
將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng),，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部,，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基,。如系細(xì)胞培養(yǎng),，一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進行細(xì)胞計數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細(xì)胞數(shù)表示）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基,。細(xì)胞進入培養(yǎng)器皿后,，立即放入培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞盡早進入生長狀態(tài),。
正在培養(yǎng)中的細(xì)胞應(yīng)每隔一定時間觀察一次,，觀察的內(nèi)容包括細(xì)胞是否生長良好，形態(tài)是否正常,，有無污染,，培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示）,，此外對培養(yǎng)溫度和CO2濃度也要定時檢查。
一般原代培養(yǎng)進入培養(yǎng)后有一段潛伏期（數(shù)小時到數(shù)十天不等）,，在潛伏期細(xì)胞一般不分裂,，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細(xì)胞進入旺盛的分裂生長期,。細(xì)胞長滿瓶底后要進行傳代培養(yǎng),，將一瓶中的細(xì)胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代",。二倍體細(xì)胞一般只能傳幾十代,，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或細(xì)胞株則可無限地傳代下去。轉(zhuǎn)化細(xì)胞可能具有惡性性質(zhì),，也可能僅有不死性（Immortality）而無惡性,。培養(yǎng)正在生長中的細(xì)胞是進行各種生物醫(yī)學(xué)實驗的良好材料。
四,、凍存及復(fù)蘇
為了保存細(xì)胞,，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存,。凍存的溫度一般用液氮的溫度—－196℃,，將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存,，最終保存于液氮中,。在極低的溫度下，細(xì)胞保存的時間幾乎是無限的,。
復(fù)蘇一般采用快融方法,，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中,，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng),。
凍存過程中保護劑的選用,、細(xì)胞密度、降溫速度及復(fù)蘇時溫度,、融化速度等都對細(xì)胞活力有影響,。
培養(yǎng)具體步驟：
1.準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒20分鐘,。開始工作前先洗手,、75%酒精擦拭手至肘部。
2.布局：點燃酒精燈,，安裝吸管帽,。
3.處理組織：把組織塊置于燒杯中,，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污,；如懷疑組織可能污染,，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60分鐘。
4.剪切：用眼科剪把組織切成2~3毫米大小的塊,，以便于消化,。加入比組織塊總量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中,，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞,。
5.消化：或用恒溫水浴，或置于37℃溫箱消化均可,，消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動一次,，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定,。
6.分離：在消化過程中見消化液發(fā)混濁時,，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細(xì)胞團或單個細(xì)胞,，立即終止消化,，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊,。低速（500~1000轉(zhuǎn)/分）離心消化液5分鐘,，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液,。
7.計數(shù)：用計數(shù)板計數(shù),，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過大，再補加培養(yǎng)液調(diào)整后,，分裝入培養(yǎng)瓶中,。對大多數(shù)細(xì)胞來說，pH要求在7.2~7.4范圍,，培養(yǎng)液呈微紅色,，如顏色偏黃，說明液體變酸,，可用NaHCO3調(diào)整,。
8.培養(yǎng)：置于36.5℃溫箱培養(yǎng)，如用CO2溫箱培養(yǎng),，瓶蓋需擰松半圈,。