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      PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素主要有引物的選擇與設(shè)計(jì),，酶的質(zhì)量,。模板的制備,，在前二者都穩(wěn)定可行的情況下,，PCR模板的制備尤為重要。模板處理方法的選擇及操作人員的基 本技能,，決定分離模板核酸(DNA或RNA)的質(zhì)和量及PCR的成敗,。而提高模板核酸質(zhì)量的 關(guān)鍵是除去雜質(zhì)(蛋白質(zhì),、酶,、脂肪等)。除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子,，提高模板核酸的產(chǎn)量,。

傳統(tǒng)的核酸模板提取方法是采用去垢劑如SDS等來破壞細(xì)胞組份，溶解細(xì)胞膜,，使蛋白質(zhì)變性,，再用蛋白酶K來消化去除蛋白質(zhì)，尤其是與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì),，再用酚:抽提,，然后用乙醇或異丙醇沉淀核酸，供PCR實(shí)驗(yàn)用,。但近幾年來也發(fā)展了些 簡便實(shí)用較為有效的標(biāo)本消化處理方法,。亦可滿足PCR實(shí)驗(yàn)的要求。采用哪種方法消化 處理標(biāo)本,，視PCR實(shí)驗(yàn)的目的(是科研還是檢測)及環(huán)境條件而定,。

模板核酸的提取辦法：

一、蛋白酶K消化裂解法：適用于所有標(biāo)本的消化處理，尤以DNA樣品為佳,。如組 織細(xì)胞(包括石蠟包埋組織)絨毛,、毛發(fā)、精斑,、血液(血清,、血漿、全血)局部分泌 物,、尿,，糞便等。

1,、試劑配制

1）蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)

10mmol/LEDTA

150mmol/LNaCL

0.5%SDS

100～200ug/ml蛋白酶K.

2）蛋白酶K最好用水配成20mg/ml,，臨用時(shí)加入消化液中。

2,、提取方法:

有些標(biāo)本,、在用蛋白酶K消化前，還需預(yù)處理一下,，如糞便,、分泌物、痰液,、組 織塊,、石蠟包埋組織等，其方法有離心去掉雜質(zhì),，脫蠟等,。

臨床標(biāo)本或經(jīng)預(yù)處理的標(biāo)本加蛋白酶K裂解液50～100ul.混勻，55℃1～3小時(shí),， 或37℃過夜,。加等體積的飽和酚抽提1～2次，再加等體積的:(49:1)抽提一 次,，上清加入1/10體積的pH值5.23mmol/L醋酸鈉緩沖液,，加入2.5倍體積的冰冷無水 乙醇(或加等體積的異丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000轉(zhuǎn)/min離心15min.小心吸 棄或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min離心洗滌1～2次,，特別小心的 吸棄或倒掉上清,，真空或37℃溫箱或室溫干燥，加TE緩沖液20ul.溶解后,，取3～8ul 用于PCR擴(kuò)增,，或放-20℃保存。

蛋白酶K消化法除上述經(jīng)典處理法外,，亦可在蛋白K消化處理標(biāo)本,，經(jīng)離心處理 后,，吸取上清經(jīng)95～97℃或煮沸10min滅活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR擴(kuò)增,。 如雜質(zhì)較多,，還可經(jīng)酚:抽提后，即可用于PCR反應(yīng),。此法蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)消除 *,，Taq酶活性不受影響，具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性,。但操作繁復(fù),，技術(shù)要求高。

二,、直接裂解法: 標(biāo)本(組織細(xì)胞,，分泌物)加PBS或生理鹽水離心洗滌后，加消化 裂解液20～50ul(0.5%NP-40和0.5%吐溫-20),，95～98℃,，15～30min以裂解病原體，裂解細(xì)胞,。然后12000r/min離心5～10min,，取上清20～30ul用于PCR擴(kuò)增。血清標(biāo)本可 直加等體積的消化液,，加熱處理離心后PCR擴(kuò)增,。亦有用5%的NP-40和1.5%2-ME做裂解 液，95℃30min消化處理,，離心取上清,，PCR擴(kuò)增檢測HBV DNA.

三、堿變性法: 取血清20ul,，加入1mol/L NaOH 20ul,，37℃30min,，離心,，加 1mol/L HCl 20ul，離心后,，取上清5ul,，用于PCR擴(kuò)增。*亦有用10ul血清加NaOH至 0.2mol/L,，37℃1h,，再加HCL中和離心后取上清10ul做PCR，其特異性和敏感性較前法 更好,。

四,、煮沸法: 經(jīng)離心洗滌過的組織細(xì)胞，分泌物及血液標(biāo)本，加適量無菌蒸餾水或PBS,，混勻 后,，100℃煮沸10～15min，14000r/min 10min,，取上清做PCR.

五,、碘化鈉法: 取組織細(xì)胞及抗凝血液10～100ul，加等體積的6MNaI,，反復(fù)輕混 20s,，加等體積:(49:1)振勻后，離心取上清加0.6體積的異丙醇,，混勻后 置室溫3min.14000r/min 10min,，沉淀加10～100ul，TE溶解,，取5～10ul做PCR,，亦有 用100ul血清加裂解液300ul(6M NaI，0.5%十二烷基肌酸鈉,，10ug糖原,，26mmol/L pH8.0 Tris-HCL，13mmol/LEDTA)混勻后,，60℃15min,，加等體積異丙醇，離心沉定 后,，加TE液用于PCR擴(kuò)增,，其產(chǎn)量和質(zhì)量較高。

六,、異硫氰酸胍法

此法主要用于RNA的提取,。標(biāo)本為組織細(xì)胞及血清等。

1,、異硫氰酸胍消化液

異硫氰酸胍4mol/L

檸檬酸鈉(PH7.0)25mmol/L

十二烷基肌酸鈉0.5%

β-巰基乙醇0.1mol/L

2,、消化方法: 用50～100ul細(xì)胞懸液及血清，加等體積的異硫氰酸胍消化液振混勻 后,，或65℃1小時(shí),，或室溫放置數(shù)分鐘，然后加1/10體積的3mmol/L pH5.2的醋酸鈉緩 沖液,，再加等體積的酚:,，用力振搖約10s，10000r/min,，離心5min,，取上清加等 體積異丙醇-20℃放置3h后,，14000r/min離心15min，沉定用75%冰冷乙醇離心洗滌1～ 2次,，真空干燥,，沉淀用TE緩沖液溶解即可用于逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，或放-20℃保存,。

其它消化處理標(biāo)本提模板核酸的方法有①異硫氰酸胍一二氧化硅法②異硫氰酸胍-玻璃粉法,。③Chelex-100法。④全血直接擴(kuò)增法⑤尿素消化裂解法,。各有千秋,，可根據(jù)情況選用。