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各種常見種類PCR概述介紹
閱讀：1619 發(fā)布時(shí)間：2023-12-4PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction）的簡(jiǎn)稱,，是一種體外擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),。PCR的常見種類分述如下：
1,、普通PCR
普通PCR即一代PCR,，使用普通PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增靶基因,，并通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定性分析,。
2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）
實(shí)時(shí)熒光定量PCR,，也叫Real-Time PCR,，即二代PCR，是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光染料或者熒光基團(tuán),，在整個(gè)PCR過程中通過收集熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)每一個(gè)循環(huán)中擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和CT值對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定量分析。qPCR常用的有兩種方法：SYBR Green法和TaqMan探針法,。
①熒光染料法（SYBR Green）：SYBR Green Ⅰ是熒光定量PCR中zui 常用的熒光染料,，它能與所有的雙鏈DNA結(jié)合。在PCR反應(yīng)體系中,，加入SYBR Green Ⅰ,，它就會(huì)在過程中與雙鏈DNA結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光信號(hào),。因此,，反應(yīng)中發(fā)出的全部熒光信號(hào)就會(huì)與反應(yīng)中雙鏈DNA的量呈正比,，熒光強(qiáng)度也會(huì)隨著產(chǎn)物的增加而增加。但是由于染料與雙鏈DNA是非特異性結(jié)合,，因此可能產(chǎn)生假陽性的結(jié)果,。
優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格相對(duì)較低；使用方便,；對(duì)DNA模板沒有選擇,，通用性好；檢測(cè)靈敏度高,。
缺點(diǎn)：可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果,，需要通過熔解曲線分析識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性；需要不斷優(yōu)化反應(yīng)體系以降低非特異性擴(kuò)增,；不適合進(jìn)行多重qPCR檢測(cè),。
②熒光探針法（TaqMan技術(shù)）：TaqMan探針是最早用于定量的方法，也是臨床檢測(cè)中zui常用的檢測(cè)方法,。PCR擴(kuò)增時(shí),，加入一對(duì)引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針。該探針是一個(gè)寡核苷酸,，5'端標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)（Reporter, R）,，3'端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)（Quencher, Q）。當(dāng)探針完整時(shí),，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收,，以至于無法檢測(cè)到熒光信號(hào)；而當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)（在延伸階段）,，探針會(huì)被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解,，使報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射底的熒光不會(huì)再被吸收,，從而可以在熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收到熒光信號(hào),，即每擴(kuò)增一條DNA，就形成一個(gè)熒光分子,，PCR產(chǎn)物的形成與熒光分子的形成wan全同步,，PCR產(chǎn)物越多，熒光信號(hào)累積的越多,，熒光強(qiáng)度越大,。
優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)特異性強(qiáng)；靈敏度高,；適合進(jìn)行多重qPCR檢測(cè),；PCR后續(xù)無需處理，節(jié)省時(shí)間和原料成本。
缺點(diǎn)：需要根據(jù)不同的序列,，合成不同的探針,；探針的水解依賴Taq酶外切酶的活性，定量時(shí)容易受試劑和酶性能影響,；淬滅難以完,，本底較高；檢測(cè)結(jié)果很難判斷實(shí)際的擴(kuò)增特性,。
注：多重PCR,，也稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，是在一個(gè)反應(yīng)體系中加入兩對(duì)以上引物,，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段
的一種新型PCR擴(kuò)增技術(shù),。
3、數(shù)字PCR（Digital PCR, Dig-PCR, dPCR）
數(shù)字PCR即三代PCR,，是對(duì)原始PCR的另一種改進(jìn),，是一種能夠?qū)崿F(xiàn)核酸絕對(duì)定量的精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)，基于泊松分布原理將核酸樣品分配到大量獨(dú)立,、平行的微反應(yīng)單元（納升級(jí)）中,，使每個(gè)反應(yīng)室中平均只有一個(gè)拷貝或者沒有目標(biāo)DNA分子，然后加入熒光信號(hào)進(jìn)行擴(kuò)增,，從而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)核酸分子的絕對(duì)計(jì)數(shù),，提高檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度。
4,、逆轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscription-PCR,RT-PCR）
逆轉(zhuǎn)錄PCR也叫反轉(zhuǎn)錄PCR,，將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增相結(jié)合，是PCR的一種廣泛應(yīng)用的變形,。在RT-PCR中首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶將一條單鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板,，擴(kuò)增合成目的片段,。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物,。無論使用何種RNA,，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。RT-PCR技術(shù)靈敏且應(yīng)用廣泛,，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平,，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。一般通過一步法或兩步法進(jìn)行,，一步法是RT反應(yīng)和PCR反應(yīng)在同一試管中進(jìn)行,；而在兩步法中兩個(gè)反應(yīng)是分開依次進(jìn)行的。
5、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（Real-time RT-PCR,RT-qPCR）
Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的組合,，其中的“RT"是Reverse transcription（逆轉(zhuǎn)錄）的意思,，所以RT-qPCR就是結(jié)合了熒光定量技術(shù)的逆轉(zhuǎn)錄PCR，即以mRNA或總RNA為模板,，先反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,，再以cDNA為模板，通過熒光定量PCR進(jìn)行定量檢測(cè)分析,。因?yàn)镽T-PCR只可以定性,，但不能進(jìn)行定量分析。與RT-PCR一樣,，RT-qPCR定量分析RNA也有兩種方法：一步法和兩步法,。兩種方法都需要先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再將其作為qPCR擴(kuò)增的模板,，只是一步法中的RT和qPCR在同一試管中進(jìn)行,，兩步法中的RT和qPCR是按順序分開進(jìn)行。