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ELISA實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)“花板”結(jié)果原因與解決辦法
閱讀：153 發(fā)布時(shí)間：2023-10-30酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,， ELISA)原理是抗原或抗體的固相化及抗原抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后,，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),，由此進(jìn)行定性或定量分析。該實(shí)驗(yàn)因其靈敏度較高,，特異性較好,，操作較簡單,，可大批量操作而廣泛應(yīng)用于多種傳染性疾病的篩查工作中。然而,，“花板"現(xiàn)象的出現(xiàn)，往往會給實(shí)驗(yàn)者判讀結(jié)果帶來麻煩,。所謂“花板",，就是空白、陰性、陽性對照及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常,，而標(biāo)本孔的OD值卻偏高，弱陽性結(jié)果較多,。對“花板"現(xiàn)象進(jìn)行了分析和總結(jié),，認(rèn)為花板原因大多在樣品,，解決辦法主要在洗滌，孵育和顯色過程也會導(dǎo)致,。
1、花板原因大多在樣品
所謂“花板",，就是空白,、陰陽性對照及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常，而標(biāo)本孔的OD值卻偏高,。之所以空白、對照及質(zhì)控結(jié)果正常而標(biāo)本孔異常,，是因?yàn)闃悠繁旧淼脑?，大部分或全部?biāo)本孔的OD值偏高,，很可能是因?yàn)闃悠分心承┕灿械奈镔|(zhì)非特異性的吸附于固相載體，而在實(shí)驗(yàn)的過程中未被除去,。
1.1、 待測血清中混有紅細(xì)胞或纖維蛋白原 這兩種物質(zhì)易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈,，實(shí)驗(yàn)表明在較高的離心轉(zhuǎn)速(3000 /min)和較長的離心時(shí)間(>10 min)之下,，血液標(biāo)本被充分地離心分離之后,，使紅細(xì)胞和纖維蛋白充分沉淀，可以在加樣時(shí)避免加入紅細(xì)胞和纖維蛋白,，避免這兩種干擾物質(zhì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,，就可避免“花板"情況,。
1.2、高IgG血癥 在實(shí)際工作中，檢測丙肝的實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)花板的情況較多,，原因之一是因?yàn)槟壳皣鴥?nèi)外的抗-HCV EIA試劑均采用間接酶聯(lián)免疫檢測原理,，間接法的一個(gè)重要影響因素是血清中所含的高濃度的非特異性IgG，IgG對聚苯乙烯有較強(qiáng)的吸附力,，非特異性IgG可吸附到固相載體上或包被的抗原上造成假陽性,。
1,、 解決辦法主要在洗滌
聚苯乙烯因其具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能而被廣泛用于ELISA實(shí)驗(yàn)的固相載體，聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,，因此需要通過洗滌清除在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌在 ELISA 過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟,，但卻決定著實(shí)驗(yàn)的成敗,。上述提到的血清中存在紅細(xì)胞或纖維蛋白原,，可以在加樣前離心時(shí)得到控制，同樣也可以通過適當(dāng)增加洗滌次數(shù)和浸泡時(shí)間減輕或避免對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,，同樣,，對于血液存在的非特異性的IgG,實(shí)驗(yàn)者很難在加樣時(shí)將其去除,，那么解決的最佳時(shí)機(jī)就是洗滌過程,。
ELISA在洗滌過程中需注意以下幾點(diǎn)：
(1)、板要平整,，尤其是在用洗板機(jī)洗板的過程中，往往是3排一起洗,，如果板不平,，就很可能造成洗液有殘留,，從而導(dǎo)致非特異性結(jié)合不能清除干凈，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾,。
(2),、洗液溫度，實(shí)驗(yàn)表明,，洗液溫度也會影響洗板的干凈程度，尤其是冬天溫度過低時(shí)容易出現(xiàn)“花板"問題,。因此,，最好保持室溫在20℃-30℃,。
(3)、洗液要注滿孔,，孔壁洗滌不干凈也易造成“花板"現(xiàn)象。
(4),、洗液要新鮮配置,，洗液要臨用前新鮮配制,，放置時(shí)間過長易產(chǎn)生絮狀物或混濁，造成賭孔或花板,。
(5),、洗板次數(shù)不夠或洗滌間隔時(shí)間過短也會造成由于洗板不凈而造成“花板",。
3、 孵育時(shí)間過長也會造成“花板"
本實(shí)驗(yàn)室曾有一段時(shí)間經(jīng)常出現(xiàn)丙肝檢測“花板"現(xiàn)象,，究其原因是由于樣本較多,，加樣后未及時(shí)放入孵育箱,，反應(yīng)板在室溫呆的時(shí)間過長，即間接增加了孵育時(shí)間,，導(dǎo)致孵育時(shí)間過長,，蛋白質(zhì)非特異性吸附于固相載體,。因此，應(yīng)嚴(yán)格控制加樣時(shí)間,，加樣后及時(shí)孵育,，標(biāo)本較多時(shí)可分批操作。
此外,，有些廠家的試劑顯色液不穩(wěn)定,，使用前容易變藍(lán),，如在實(shí)驗(yàn)前不仔細(xì)檢查，很容易導(dǎo)致“花板"現(xiàn)象的發(fā)生,，這也提醒實(shí)驗(yàn)者應(yīng)使用新鮮的顯色液,，保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
綜上所述,，將ELISA“花板"現(xiàn)象總結(jié)為：花板原因大多在樣品,，解決辦法主要在洗滌,，孵育和顯色過程也會導(dǎo)致。既然原因大多在樣品,，那么在樣品交接時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)定,，無溶血,，無凝血，足量,，單個(gè)的溶血樣品雖不致造成“花板",，但血紅蛋白中的血紅素基團(tuán),，具有類過氧化物的活性，在以辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)為標(biāo)記酶的ELISA測定中,，易在孵育過程中吸附于固相,，從而與后面加入的底物反應(yīng)顯色,，從而造成假陽性。洗滌是ELISA的關(guān)鍵步驟,，充分有效的洗滌也是避免“花板"的有利措施,。同樣，嚴(yán)格按照試劑說明孵育,，使用新鮮的顯色液也是有效避免“花板"的保障,。以上措施可以有效減少“花板"次數(shù),，從而提高檢測的特異性和準(zhǔn)確性，更好的發(fā)揮ELISA的方法學(xué)優(yōu)勢,。