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      聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是在體外進(jìn)行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：①模板核酸的制備,；②引物的質(zhì)量與特異性；③酶的質(zhì)量；④PCR條件,。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析檢測(cè)。

1,、 模板

a．模板質(zhì)量不佳,，含有雜蛋白質(zhì)，特別是染色體中的組蛋白,；模板核酸變性不夠,；提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚,。建議選擇質(zhì)量可靠的提取試劑,，重新提取高純度基因組模板；若模板為cDNA,，需要檢查逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及其所用RNA的純度及完整度,。

b．模板中含有尿嘧啶抑制高保真酶的活性，或含有Taq酶抑制劑,。

c．模板濃度過高,，或含有一些buffer，抑制PCR擴(kuò)增，如cDNA模板,，建議稀釋后再使用,。

d．靶序列變異。如靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結(jié)合,，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，導(dǎo)致PCR不能有效擴(kuò)增,。

2,、引物：引物的設(shè)計(jì)、引物質(zhì)量是PCR擴(kuò)增成敗的關(guān)鍵,。

a．引物設(shè)計(jì)不合理,，如引物長(zhǎng)度不夠、引物之間形成二聚體等,，需要重新設(shè)計(jì)引物。

b．合成高質(zhì)量,、高純度級(jí)別的引物,。

c．引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期4℃保存,，導(dǎo)致引物降解失效,。

3、  酶的質(zhì)量：

a．酶失活,，建議更換新酶,，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或活性降低而導(dǎo)致沒有產(chǎn)物,。

b．酶擴(kuò)增效率低,，建議更換擴(kuò)增效率高的酶。

4,、 PCR條件:

a．PCR擴(kuò)增條件：變性對(duì)PCR擴(kuò)增相當(dāng)重要,，如變性溫度低、變性時(shí)間短都有可能出現(xiàn)擴(kuò)增無(wú)產(chǎn)物,；退火溫度過低,，可導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率；退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率,。

b．Mg2+濃度：Mg2+濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大,，濃度過高會(huì)降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗,。

c．反應(yīng)體系：反應(yīng)體系配制錯(cuò)誤,，建議重復(fù)實(shí)驗(yàn)。通常進(jìn)行PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)采用的是小體系，正式實(shí)驗(yàn)如需擴(kuò)大體系時(shí),，一定要重新摸索條件,，否則容易出現(xiàn)擴(kuò)增效果不理想或者失敗。