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有關(guān)RT-PCR詳細(xì)闡述
閱讀：199 發(fā)布時間：2023-10-16 RT-PCR是指將逆轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription,；RT)反應(yīng)和PCR (Polymerase Chain Reaction)反應(yīng)組合在一起的方法。
1,、 RT-PCR的原理
RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起,，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對表達(dá)信息進(jìn)行檢測或定量,。另外,，這項(xiàng)技術(shù)還可以用來檢測基因表達(dá)差異或不必構(gòu)建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡,、RNase保護(hù)分析,、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏,，更易于操作,。
RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶,，以隨機(jī)引物,、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行,。在兩步法RT-PCR中,，每一步都在最佳條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行,，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR,。在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下,，在一只管中順次進(jìn)行,。
2,、 RT-PCR的步驟
⑴在冰浴離心管里面加入模板RNA 4uL，引物2uL,，去離子水5uL,，混勻，離心3-5秒,；
⑵70度水浴5分鐘,，冰浴30秒（此處是為了使引物和模板正確配對）；
⑶加入5×反應(yīng)液4uL,，RNase抑制劑1uL,，dNTP 2uL（這些應(yīng)該先配好，然后分再裝到每一管）,，混勻,；
⑷37度水浴5分鐘，加入1uL AMV-RT反轉(zhuǎn)錄酶,，混勻,；
⑸37度水浴1小時（此步是反轉(zhuǎn)錄過程）；
⑹70度10分鐘結(jié)束反應(yīng)（此處是滅活酶活性,，避免對后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾）,，產(chǎn)物置冰上進(jìn)行下一步PCR實(shí)驗(yàn)，余下的-70度保存,。
3,、 RT-PCR的引物設(shè)計(jì)
RT-PCR引物設(shè)計(jì)和一般PCR引物設(shè)計(jì)可以遵循同樣的原則。細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計(jì)是PCR中最重要的一步,。理想的引物對只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火,。設(shè)計(jì)糟糕的引物可能會同擴(kuò)增其他的非目的序列。設(shè)計(jì)理想的引物都有以下共同的特點(diǎn),，而設(shè)計(jì)失敗的引物則各有各的缺點(diǎn)：
* 典型的引物18到24個核苷長,。引物需要足夠長，保證序列獨(dú)te性,，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性,。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交,，降低了特異性,，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量,。
* 選擇GC含量為40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物,。
* 設(shè)計(jì)5'端和中間區(qū)為G或C的引物。這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。
* 避免引物對3'末端存在互補(bǔ)序列,，這會形成引物二聚體,，抑制擴(kuò)增。
* 避免3'末端富含GC,。設(shè)計(jì)引物時保證在最后5個核苷中含有3個A或T,。
* 避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸,。
* 避免存在可能會產(chǎn)生內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的序列,，這會破壞引物退火穩(wěn)定性。
目的序列上并不存在的附加序列,，如限制位點(diǎn)和啟動子序列,，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當(dāng)計(jì)算引物Tm值時并不包括這些序列,，但是應(yīng)該對其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的檢測,。
引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲存在-20℃,。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周,。干粉引物可以在-20℃保存至少1年,，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個月。
4,、引物退火溫度
引物的另一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）,。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的,。在理想狀態(tài)下,，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火,，同時還要足夠高,，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃,。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃,。
根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大,。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋€估算的Tm值,，所有退火溫度只是一個起始點(diǎn)?？梢酝ㄟ^分析幾個逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性,。開始低于估算的Tm 5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度,。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成,。為獲得最佳結(jié)果，兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值,。引物對的Tm差異如果超過5℃,，就會由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同,，將退火溫度設(shè)定為比Tm低5℃,。或者為了提高特異性,，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個循環(huán),，然后再根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下可以獲得目的模板的部分拷貝,。
5,、提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度
較高的保溫溫度有助于RNA二級結(jié)構(gòu)的打開，增加了反應(yīng)的產(chǎn)量,。對于多數(shù)RNA模板,，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫,，然后迅速置于冰上冷卻,，可以消除大多數(shù)二級結(jié)構(gòu)，從而使引物可以結(jié)合,。然而某些模板仍然會存在二級結(jié)構(gòu),，即使熱變性后也是如此。較高的保溫溫度也可以增加特異性,，尤其是當(dāng)使用基因特異性引物（GSP）進(jìn)行cDNA合成時,。如果使用GSP，確保引物的Tm值與預(yù)計(jì)的保溫溫度相同,。不要在高于60℃時使用oligo(dT)和隨機(jī)引物,。隨機(jī)引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鐘。除了使用較高的逆轉(zhuǎn)錄溫度外,，還可以通過直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉(zhuǎn)到逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度,，并加入預(yù)熱的2×的反應(yīng)混合物提高特異性（cDNA熱啟動合成）。這種方法有助于防止較低溫度時所發(fā)生的分子間堿基配對,。使用PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度切換,。
6、 促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄的添加劑
包括甘油和DMSO在內(nèi)的添加劑加到第一鏈合成反應(yīng)中,，可以減低核酸雙鏈的穩(wěn)定并解開RNA二級結(jié)構(gòu),，最多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影響或MMLV的活性,。AMV也可以耐受最多20％的甘油而不降低活性。為了在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中最大限度提高RT-PCR的靈敏度,，可以加入10％的甘油并在45℃保溫,。如果1/10的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物加入到PCR中，那甘油在擴(kuò)增反應(yīng)中的濃度為0.4％,，這不足以抑制PCR,。
在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。RNase抑制劑要在第一鏈合成反應(yīng)中,，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入,，因?yàn)閏DNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結(jié)合的可以降解RNA的RNase,。蛋白RNase抑制劑僅防止RNase A,，B，C對RNA的降解,，并不能防止皮膚上的RNase,，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase,。
使用無RNaseH活性（RNaseH-）的逆轉(zhuǎn)錄酶：逆轉(zhuǎn)錄酶催化RNA轉(zhuǎn)化成cDNA,，不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外,，都具有內(nèi)源RNaseH活性,。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復(fù)合物中的RNA鏈,。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產(chǎn)量和長度,。因此消除或大大降低逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性將會大有裨益,。RNaseH-的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及RNaseH-的AMV，比MMLV和AMV能得到更多量和更多全長,。RT-PCR靈敏度會受cDNA合成量的影響,。RT-PCR產(chǎn)物的大小受限于逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的能力，尤其是克隆較大的cDNA時,。RNaseH-的逆轉(zhuǎn)錄酶可以顯著提高長RT-PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量,，同時增加了熱穩(wěn)定性，所以反應(yīng)可以在高于正常的37-42℃的溫度下進(jìn)行,。
7,、RNaseH處理
在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應(yīng)可以提高靈敏度。對于某些模板,，據(jù)認(rèn)為cDNA合成反應(yīng)中的RNA會阻止擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合,，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當(dāng)擴(kuò)增較長的全長cDNA目標(biāo)模板時,，RNaseH處理是必需的,，比如低拷貝的。對這種困難模板,，RNaseH的處理加強(qiáng)了或AMV合成的cDNA所產(chǎn)生的信號,。對于多數(shù)RT-PCR反應(yīng)，RNaseH處理是可選的,，因?yàn)?5℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA：DNA復(fù)合物中的RNA水解掉,。
8、 小量RNA檢測方法的提高
當(dāng)僅有小量RNA時,，RT-PCR尤其具有挑戰(zhàn)性,。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產(chǎn)量?？梢栽诩尤隩rizol的同時加入無RNase的糖元,。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以輔助隨后的沉淀,。對于小于50mg的組織或106個培養(yǎng)細(xì)胞的樣品,，無RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。
9,、 一步法同兩步法RT-PCR的比較
兩步法RT-PCR比較常見,，在使用一個樣品檢測多個mRNA時比較有用。然而一步法RT-PCR具有其他優(yōu)點(diǎn),。一步法RT-PCR在處理大量樣品時易于操作,，有助于減少殘余污染，因?yàn)樵赾DNA合成和擴(kuò)增之間不需要打開管蓋,。一步法可以得到更高的靈敏度,，可以達(dá)到0.1pg總RNA，這是因?yàn)檎麄€cDNA樣品都被擴(kuò)增,。對于成功的一步法RT-PCR,，一般使用反義的基因特異性引物起始cDNA合成。
10,、 增加RT-PCR特異性
第一鏈cDNA合成的起始可以使用三種不同的方法,，各種方法的相對特異性影響了所合成cDNA的量和種類。
隨機(jī)引物法是三種方法中特異性的,。引物在整個轉(zhuǎn)錄本的多個位點(diǎn)退火,，產(chǎn)生短的，部分長度的cDNA,。這種方法經(jīng)常用于**5'末端序列及從帶有二級結(jié)構(gòu)區(qū)域或帶有逆轉(zhuǎn)錄酶不能復(fù)制的終止位點(diǎn)的RNA模板獲得cDNA,。為了獲得最長的cDNA,，需要按經(jīng)驗(yàn)確定每個RNA樣品中引物與RNA的比例。隨機(jī)引物的起始濃度范圍為50到250ng每20μl反應(yīng)體系,。因?yàn)槭褂秒S機(jī)引物從總RNA合成的cDNA主要是核糖體RNA,，所以模板一般選用poly(A)+RNA。
Oligo(dT)起始比隨機(jī)引物特異性高,。它同大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA 3'端所發(fā)現(xiàn)的poly(A)尾雜交,。因?yàn)閜oly(A)+RNA大概占總RNA的1%到2％，所以與使用隨機(jī)引物相比,，cDNA的數(shù)量和復(fù)雜度要少得多,。因?yàn)槠漭^高的特異性，oligo(dT)一般不需要對RNA和引物的比例及poly(A)+選擇進(jìn)行優(yōu)化,。建議每20μl反應(yīng)體系使用0.5μg oligo(dT),。oligo(dT)12-18適用于多數(shù)RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20,，因?yàn)槠錈岱€(wěn)定性較好,，適用于較高的保溫溫度。
基因特異性引物（GSP）對于逆轉(zhuǎn)錄步驟是特異性引物,。GSP是反義寡聚核苷,，可以特異性地同RNA目的序列雜交，而不象隨機(jī)引物或oligo(dT)那樣同所有RNA退火,。用于設(shè)計(jì)PCR引物的規(guī)則同樣適用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)GSP的設(shè)計(jì),。GSP可以同與mRNA3'最末端退火的擴(kuò)增引物序列相同，或GSP可以設(shè)計(jì)為與反向擴(kuò)增引物的下游退火,。對于部分?jǐn)U增對象,，為了成功進(jìn)行RT-PCR，需要設(shè)計(jì)多于一個反義引物,，因?yàn)槟康腞NA的二級結(jié)構(gòu)可能會阻止引物結(jié)合,。建議在20μl的第一鏈合成反應(yīng)體系中使用1pmol反義GSP。
11,、 提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度
為了充分利用GSP特異性的全部優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)該使用有較高熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶,。熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶可以在較高溫度保溫以增加反應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)性,。比如，如果一個GSP退火溫度為55℃,，那么如果使用AMV或M-MLV在低嚴(yán)謹(jǐn)性的37℃進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,，GSP所帶有的特異性就沒有利用。然而某些特別的逆轉(zhuǎn)錄酶可以在50℃或更高進(jìn)行反應(yīng),，這就會消除較低溫度時產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物,。為獲得最大的特異性,，可以將RNA/引物混合物直接從65℃變性溫度轉(zhuǎn)移到逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度。這有助于防止低溫時分子間堿基配對,。使用PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度轉(zhuǎn)換,。
12、 減少基因組DNA污染
RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是RNA中沾染的基因組DNA,。使用較好的RNA分離方法,，如Trizol，會減少RNA制備物中沾染的基因組DNA,。為了避免產(chǎn)生于基因組DNA的產(chǎn)物,，可以在逆轉(zhuǎn)錄之前使用擴(kuò)增級的DNaseⅠ對RNA進(jìn)行處理以除去沾染的DNA。將樣品在2.0mM EDTA中65℃保溫10分鐘以終止DNaseⅠ消化,。EDTA可以螯合鎂離子,，防止高溫時所發(fā)生的依賴于鎂離子的RNA水解。
為了將擴(kuò)增的cDNA同沾染的基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物分開,，可以設(shè)計(jì)分別同分開的外顯子退火的引物,。來源于cDNA的PCR產(chǎn)物會比來源于沾染的基因組DNA的產(chǎn)物短。另外對每個RNA模板進(jìn)行一個無逆轉(zhuǎn)錄的對照實(shí)驗(yàn),，以確定一個給定片段是來自基因組DNA還是cDNA,。在無逆轉(zhuǎn)錄時所得到的PCR產(chǎn)物來源于基因組。