日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

1,、引物的特異性決定PCR反應(yīng)特異性,。因此引物設(shè)計(jì)是否合理對于整個實(shí)驗(yàn)有著至關(guān)重要的影響,。在引物設(shè)計(jì)時要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型,，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA對引物的特異性的影響,。盡量選擇覆蓋相連兩個內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達(dá)過程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子,。

2、引物設(shè)計(jì)原則的把握包括:

1、.引物長度:一般為15～30 bp ,，引物太短會影響PCR的特異性,，引物太長PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最適溫度，也影響反應(yīng)的特異性,。

2,、.堿基分布：四種堿基最好應(yīng)隨機(jī)分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在,，特別是連續(xù)出現(xiàn)3個以上的單一堿基,。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR擴(kuò)增的復(fù)性溫度一般是較低Tm值減去5～10度,。

3,、3‘端要求：3’端必須與模板嚴(yán)格互補(bǔ)，不能進(jìn)行任何修飾,，也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)的可能,。末位堿基是A時錯配的引發(fā)效率zui低，G,、C居中間,，因此引物的3’端最好選用A、G,、C而盡可能避免連續(xù)出現(xiàn)兩個以上的T,。

4、引物自身二級結(jié)構(gòu)：引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,，否則會自身折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)或引物自身復(fù)性,。

5、引物之間的二級結(jié)構(gòu)：兩引物之間不應(yīng)有多于4個連續(xù)堿基互補(bǔ),，3’端不應(yīng)超過2個,。

6、同源序列：引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于連續(xù)8個的互補(bǔ)堿基存在,。

g.5’端無嚴(yán)格限制：5’末端堿基可以游離,，但最好是G或C，使PCR產(chǎn)物的末端結(jié)合穩(wěn)定,。還可以進(jìn)行特異修飾（標(biāo)記,、酶切位點(diǎn)等）等等。

  根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適當(dāng)?shù)囊?。常用引物設(shè)計(jì)軟件如Primer5.0,，Oligo6.0等對于這些條件都可以自行設(shè)置。