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PCR反應(yīng)主要五種物質(zhì)
閱讀：511 發(fā)布時(shí)間：2023-3-13PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物,、酶,、dNTP、模板和Mg2+,。
1,、引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以zui低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。
2,、酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng),， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶,。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)),，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少,。
3,、dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀,，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性,。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后,，以1M NaOH或1M Tris,。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝,， -20℃冰凍保存,。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中,，dNTP應(yīng)為50～200umol/L,，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制),，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配,。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量,。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低,。
4,、模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本,。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜,，并解離細(xì)胞中的核蛋白,，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì),，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸,。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng),。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞,，裂解病原體,，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增,。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,，要防止RNase降解RNA。
5,、Mg2+濃度 Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí),，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜,。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低,，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性,，使反應(yīng)產(chǎn)物減少,。