化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
ELISA實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線分析
閱讀：334 發(fā)布時(shí)間：2023-2-15標(biāo)準(zhǔn)曲線法也稱為外標(biāo)法或直接比較法,，是一種簡(jiǎn)便,、快速的定量方法，在ELISA實(shí)驗(yàn)中比較常用的一種分析方法,。
一,、ELISA試劑盒做標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品檢測(cè)時(shí)有幾個(gè)問題需要注意
1、樣品的濃度等指標(biāo)是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出來的,，所以首先要把做標(biāo)準(zhǔn)曲線看作是比做正式實(shí)驗(yàn)還要重要的一件事,，否則后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無從談起。
2,、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍要有一個(gè)比較大的跨度,，并且要能涵蓋你所要檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣品的濃度，即樣品的濃度要在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi),，人ELISA試劑盒包括上限和下限,。而對(duì)于呈S型的標(biāo)準(zhǔn)曲線，盡量要使實(shí)驗(yàn)樣品的濃度在中間坡度最陡段,，即曲線幾乎成直線的范圍內(nèi),。
3、采用倍比稀釋法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線中的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度,，這樣就能夠保證標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度不會(huì)出現(xiàn)較大的偏離,。
4、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí),，應(yīng)按濃度遞增順序進(jìn)行,，以減少高濃度對(duì)低濃度的影響，提高準(zhǔn)確性,。
5,、標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品數(shù)一般為7個(gè)點(diǎn)，但至少要保證有5個(gè)點(diǎn),。
6,、做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)因?qū)嶒?yàn)要求不同而有所變動(dòng),，但一般來說，相關(guān)系數(shù)R至少要大于0.98,，對(duì)于有些實(shí)驗(yàn),，至少要0.99甚至是0.999.
二、ELISA試劑盒選擇什么方程去擬合
在S曲線的低濃度部門可以用乘冪方程很好的擬合,，中低濃度部門可以用直線方程,，中間部門可用對(duì)數(shù)方程，而中后段可用四參數(shù),。免疫檢測(cè)時(shí)尺度點(diǎn)(可以是倍比稀釋的,，也可以不是)濃度假如和相應(yīng)的吸光度(OD)值假如能夠呈現(xiàn)直線關(guān)系當(dāng)然是理想的了，這時(shí)可以通過EXELL等利便的獲得擬合曲線,，進(jìn)而推算出樣品的濃度值,。
關(guān)于尺度曲線的擬合方式，直線,、二次曲線,、三次曲線、指數(shù),、對(duì)數(shù)等雖都可用于ELISA及其它生物學(xué)反應(yīng)中的曲線擬合,，但都只合用于曲線的一部門，有的合用于前半段,，有的合用于后半段,，有的合用于中間一段，而Logistic曲線則對(duì)曲線的全部都有較好的合用性,。在一個(gè)長(zhǎng)的區(qū)間內(nèi),，Logistic應(yīng)該都能擬合得較為理想。假如用來定量,，S形曲線的中間段(較陡處)是比較好的,，而兩真?zhèn)€平坦部門計(jì)算誤差會(huì)大，有時(shí)甚至?xí)艽?。用于免疫檢測(cè)的所謂“尺度曲線"實(shí)在稱為擬合曲線比較合適,。目前國(guó)際上流行的免疫檢測(cè)擬合方式是“四參數(shù)邏輯擬合"，用這種擬合方式往往能夠比較準(zhǔn)確的反映濃度和吸光度的曲線關(guān)系,，從而進(jìn)一步比較準(zhǔn)確的獲得樣品中待測(cè)物質(zhì)的濃度值。但我們做免疫檢測(cè)很少有時(shí)候能夠有這么理想的情況,，標(biāo)品濃度和相應(yīng)OD值往往是"ELISA試劑盒S"型的曲線關(guān)系,，這時(shí)就不能用直線擬合的方式了，而對(duì)擬合方法進(jìn)行選擇就是必要的了,。樞紐在于你的尺度曲線做到了S形的哪一部門,，你想檢測(cè)的樣品濃度在曲線的哪一部門,。人ELISA試劑盒當(dāng)然，假如用于定量,，仍是在中間一段較好,。但建模型是一回事，而用它來定量是另一回事,。這些方法固然沒有一種方法可以通用,，但也都可以用。但并不是說它就是萬能的,。事實(shí)上不僅是ELISA試劑盒,，其它良多生物學(xué)反應(yīng)都是S形曲線，也都可以用Logistic曲線擬合,。