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?PCR反應(yīng)污染原因與對(duì)策
閱讀：258 發(fā)布時(shí)間：2022-10-17 PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與很高的靈敏性,，但令人頭痛的問題是易污染,，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。
一,、污染原因
1,、標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí),，由于密封不嚴(yán)溢于容器外,，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散,，導(dǎo)致彼此間的污染,。
2、PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中,，由于加樣槍,、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.
3,、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染:這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題,，因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個(gè)拷貝的極限,，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染,，就可造成假陽就可形成假陽性。
還有一種容易忽視,，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管,，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝,，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題.
4、實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對(duì)照的檢驗(yàn)室,，這個(gè)問題也比較常見,。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒,，由于活細(xì)胞的生長繁殖的簡便性及具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大,。
污染的監(jiān)測
一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室,，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染,，以便采取措施,，防止和消除污染。
防止污染的方法：
1,、合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理,、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行,，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開,。最好能劃分
①標(biāo)本處理區(qū);
②PCR反應(yīng)液制備區(qū);
③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);
④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用,，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA,。
2、吸樣槍:吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問題,。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源,，因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心，吸樣要慢,，吸樣時(shí)盡量一次性完成,，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染,。
3,、預(yù)混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能,，PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝,，-20℃保存,。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會(huì)。另外,，PCR試劑,，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱,。
4,、防止操作人員污染，使用一次性手套,、吸頭,、小離心管應(yīng)一次性使用。
5,、設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照和陰性對(duì)照,，陽性對(duì)照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性,，每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對(duì)照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對(duì)照,。
6、減少PCR循環(huán)次數(shù),，只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測水平就適可而止,。
7、選擇質(zhì)量好的Eppendorf管,，以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入,，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部,。開管動(dòng)作要輕,，以防管內(nèi)液體濺出。