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引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度,。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列,， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：

??1,、引物長(zhǎng)度： 5-30bp,，常用為20bp左右。

??2,、引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜,，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至0kb的片段。

??3,、引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC隨機(jī)分布,，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

??4,、避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二結(jié)構(gòu),，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ),，否則會(huì)形成引物二聚體,，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

??5,、引物3'端的堿基,，特別是末及倒數(shù)二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗,。

??6、引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn),， 被擴(kuò)增的靶序列有適宜的酶切位點(diǎn),， 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。

??7,、引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性,。

??引物量：每條引物的濃度0.～umol或0～00pmol,，以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì),。