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雙抗體夾心法適用于測定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價(jià)抗原,，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心,。

1、將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),，形成固相抗體,。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

2,、加受檢標(biāo)本,，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合,，形成固相抗原抗體復(fù)合物,。 洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。

3,、加酶標(biāo)抗體,，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合 的酶標(biāo)抗體,。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān),。

4、 加底物顯色,。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物,。通過比色，測知標(biāo)本中抗原的量,。

 在臨床檢驗(yàn)中,，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg,、HBeAg,、 AFP、hCG等,。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體,，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清,，包被和酶標(biāo)用的抗體分別取自不同種屬的動(dòng)物,。如應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇兩個(gè)針對(duì)抗原上不同決定簇的單抗,，分別用于包被固相 載體和制備酶結(jié)合物,。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng),，作一步檢測,。 在一步法測定中，當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí),，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo) 抗體結(jié)合,，而不再形成夾心復(fù)合物。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象,，此時(shí)反應(yīng) 后顯色的吸光值(位于抗原過剩帶上)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(位于抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同,。