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ELISA實(shí)驗(yàn)過程中的常見問題解答
閱讀：1319 發(fā)布時(shí)間：2021-6-9科研ELISA實(shí)驗(yàn)中會(huì)遇到很多問題，不是這有點(diǎn)小問題,，就是那有點(diǎn)小問題,。以下七點(diǎn)是我們?cè)诙嗄甑膶?shí)驗(yàn)過程中遇到問題的總結(jié)：
1、標(biāo)曲不顯色或顯色很弱,，樣本顯色
溶解標(biāo)準(zhǔn)品以及倍比稀釋時(shí),，未渦旋震蕩或不夠充分。標(biāo)準(zhǔn)品溶解,、倍比稀釋時(shí)均需要渦旋震蕩以保證充分混勻,。單純依靠移液器反復(fù)吹打，效率較低,、效果也不一定最佳,。
2、標(biāo)曲和樣本均不顯色
在孵育階段靜置在桌面上,，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸,，導(dǎo)致顯色偏弱，推薦孵育階段,，使用ELISA專用的微孔板振蕩器,，調(diào)至合適的頻率，使抗原抗體充分接觸,，保證結(jié)合效果,。如果排除上述原因，有可能是漏加了某個(gè)組分,，如檢測(cè)抗體,、酶等。對(duì)于比較馬虎的新手,，一定要做好標(biāo)記和記錄,，或者使用添加染料的ELISA試劑盒,。
3、標(biāo)曲顯色,，樣本不顯色
當(dāng)樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強(qiáng),，就無法檢測(cè)到。目前ELISA仍然是蛋白檢測(cè)靈敏度的方法,，與不同技術(shù)結(jié)合后,，衍生出了多種類型的ELISA，提高了檢測(cè)靈敏度,。
對(duì)于目的蛋白濃度特別低的樣本,，可以嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著一定能檢測(cè)到樣本濃度,，只能說可以提高樣本的可測(cè)率,，并使結(jié)果更加可靠。因?yàn)橥ǔＳ闷胀‥LISA檢測(cè)的樣本OD值都偏低,，而高敏ELISA可提高樣本OD值,，使之盡量位于標(biāo)曲范圍內(nèi)，得到的數(shù)值也更加可信,。
4,、標(biāo)曲和樣本都顯色，但復(fù)孔的CV大
這個(gè)問題就跟移液器和實(shí)驗(yàn)者的操作有關(guān)了,。移液器的使用維護(hù)不規(guī)范,，就會(huì)造成移液的誤差較大；實(shí)驗(yàn)者自身的操作習(xí)慣,、加樣的一致性對(duì)復(fù)孔的CV也有很大影響,。
掌握移液器的正確使用和維護(hù)。關(guān)于個(gè)人的操作可練習(xí)移液動(dòng)作,、加快速度,，確保移液的精密度。
5,、本底偏高,，樣本值測(cè)不到
標(biāo)曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對(duì)于高敏ELISA可以適當(dāng)放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時(shí)候,，本底過高會(huì)掩蓋目的信號(hào),，導(dǎo)致無法測(cè)到樣本值。
在加入TMB顯色后,，需實(shí)時(shí)觀察標(biāo)曲顯色情況,。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍(lán)色，即可終止反應(yīng),。
6,、樣本經(jīng)不同梯度稀釋,，計(jì)算得到的樣本值差異較大
有時(shí)候我們不清楚樣本中目的蛋白的濃度如何，應(yīng)該如何稀釋,，那么我們就會(huì)做下預(yù)實(shí)驗(yàn),，確定稀釋倍數(shù)。然而有時(shí)候同一樣本做了幾個(gè)不同梯度稀釋后,，計(jì)算得到的樣本值之間差異較大,，應(yīng)該選擇哪一個(gè)稀釋倍數(shù)呢？
這里涉及到了基質(zhì)效應(yīng),。通常血清樣本加樣量較高時(shí)，血清中的各種蛋白會(huì)抑制抗原抗體的接觸,，基質(zhì)效應(yīng)較明顯,。而經(jīng)過稀釋后，干擾因素也隨之稀釋,，影響就會(huì)較小,。當(dāng)某兩個(gè)梯度稀釋后，計(jì)算得到的樣本值接近時(shí),，我們就可以認(rèn)為在該稀釋梯度時(shí),，樣本中的干擾因素影響較小,，計(jì)算得到的值也是接近真實(shí)的,。然而這樣的稀釋是針對(duì)目的蛋白濃度較高的樣本而言。對(duì)于濃度很低的樣本,，經(jīng)過多倍稀釋后,，就更加測(cè)不到了，此時(shí)可按照說明書推薦的加樣方式操作,。
7,、不同試劑盒中的組分能否通用
除非是公用的試劑如洗液、檢測(cè)緩沖液,，其它組分不建議用其它試劑盒的組分,，甚至是同一指標(biāo)不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包括標(biāo)準(zhǔn)品,、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液,、檢測(cè)抗體、酶等)都是經(jīng)過優(yōu)化的,，如果貿(mào)然使用其它試劑盒的組分,，有可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。