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小鼠elisa試劑盒檢測步驟
閱讀：449 發(fā)布時間：2020-7-2小鼠elisa試劑盒檢測步驟：
1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：推薦分離膠濃度為8%,。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDS PAGE凝膠,。將10 × substrate G 融化,，并90 ºC 加熱5分鐘,。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍,，混勻后加入過硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合,。
2 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),，混合后直接上樣,。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液,。小鼠elisa試劑盒可通過預(yù)試驗確定加樣量,，使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。陽性對照(可選步驟)：可取人,、小鼠,、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣,。
3 低電流恒流電泳,，每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時結(jié)束電泳,。
4 洗滌凝膠：取出凝膠,，去除濃縮膠，放入容器內(nèi),?？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋),，室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘,。中間換液。
5 孵育：倒掉Buffer A,。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),，室溫或37ºC 孵育1~5 小時。陽性對照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時即可顯示,。如MMP 活性低,，應(yīng)延長孵育時間為10小時或過夜。
6 顯色：倒掉Buffer B,，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說明書）,。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域,。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2,、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72 (MMP-2),、92 (MMP-9),、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶,。
7 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描,。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑,。解決辦法：可用非透射光掃描,，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示,，并盡量設(shè)置為黑色。MMP 條帶則為白色,，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中常見的格式,。