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Taq酶在聚合酶鏈式反應細節(jié)
閱讀：1267 發(fā)布時間：2019-3-291976年Chien分離出熱穩(wěn)定聚合酶,，1986年Erlich分離并純化了適于聚合酶鏈式反應的Tq熱穩(wěn)定性聚合酶，為聚合酶鏈式反應成為實用技術奠定了基礎，現(xiàn)已用基因重組,。日前可用于聚合酶鏈式反應的聚合酶有多種：有從水生棲熱菌中提取的Taq酶、從嗜熱棲熱苗中獲得的Taq酶,、從Litoralis棲熱球菌中分離的VENT酶,、及從酸熱浴硫化裂片苗中分離的Sac酶,，而以Taq酶用得廣泛。Taq DNA聚合酶分子量為94kD,，75℃時酶比活性為150bs/酶分子,，反應溫度過高或過低均影響其延伸率，Taq蕾有很高的耐熱穩(wěn)定性,。豬elisa試劑盒實驗表明,，在92.5℃、95℃,、97.5℃時,，其半衰期分別為40min、30min和5min,。
純化的Taq酶在體外無3'-5'外切酶活性,，因而無校正閱讀功能，在擴增過程可引起錯配,。錯配堿基的數(shù)量受溫度,、Mg2+濃度和循環(huán)次數(shù)的影響。通常,，30次循環(huán)Taq酶的錯配率約為0.25％,，高于Klenow酶的錯配率。Taq酶在每一次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為1/30000,，堿基替換率為1/8000,。應用低濃度的dNTP（各20μmol／L）、1.5mmol/L的Mg2+濃度,、高于55℃的復性溫度,，可提高Taq酶的忠實性，此時的平均錯配率僅為5x10^-6次/（核苷酸*循環(huán)）,。
Taq酶具有類似于末端轉(zhuǎn)移酶的TdT的活性,，可在新生成的雙鏈產(chǎn)物的3'端加上—個堿基，尤其是dATP容易加上,。因此,，欲將聚合酶鏈式反應產(chǎn)物克隆到載體上，可以用兩種處理辦法：一是構(gòu)建dT-載體,；二是用Klenow酶將3'端的A去掉,，即在聚合酶鏈式反應反應后，先在99℃加熱10min滅活Taq酶,，調(diào)整Mg2+濃度至5-10mmol/L,，加入1-2U Klenow片段，室溫下作用15-20min，3'端的A即被切去,，
以往用Taq酶進行聚合酶鏈式反應擴增,，一般只能擴增小于400bp的DNA片段，經(jīng)過對酶的結(jié)構(gòu)與功能的改造,，以及聚合酶鏈式反應方法學的改進,，現(xiàn)已能擴增20kb以上的DNA分于。
Taq酶在聚合酶鏈式反應反應中加入的量也很重要,，太少當然不好,，太多一方面浪費，同時也導致非特異性擴增,，通常每lOOμl反應液中含1-2.5U Taq酶為好,。在0.5-5U范圍內(nèi)確定佳酶濃度。另一個問題是,，雖然Taq酶是熱穩(wěn)定性較好的工具酶,，也應注意在-20℃貯存。