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小鼠ELISA試劑盒測定操作過程
一,、原理與意義

    通過抗原和抗體在體外特異結(jié)合后出現(xiàn)的各種現(xiàn)象,對樣品中的抗原或抗體進行定性和定量檢測。本實驗采用雙抗體夾心ABC-ELISA法,用抗小鼠TNF-a單抗包被于酶標板上,標準品和樣品中的TNF-a與單抗結(jié)合,加入生物素化的抗小鼠TNF-a抗體,形成免疫復合物連接在板上,辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(Streptavidin)與生物素結(jié)合,加入酶底物鄰苯二胺(OPD),出現(xiàn)黃色,加終止液濃硫酸,顏色變深,在492nm處測OD值,TNF-a濃度與OD值成正比,可通過繪制標準曲線求出標本中TNF-a濃度,。它是樣品中蛋白質(zhì)含量檢測的定性和定量方法,。

二、試劑盒的組成

    96/48微孔板(1塊,已包被抗小鼠TNF-a單抗),、樣品稀釋液(1瓶)、抗體工作液(1瓶),、酶標抗體工作液(1瓶),、底物稀釋液(1瓶)、終止液(1瓶),、洗滌液(20×,1瓶),、標準品(2000 pg/ml,2管,凍干粉)、OPD片(3片),、坐標紙(1張),。

四、操作步驟

1,、設立標準孔8孔(根據(jù)樣品蛋白濃度可調(diào)整為6孔),每孔中先各加入樣品稀釋液100 ul,孔再加標準品100 ul,混勻后用移液器吸出100 ul,移至第二孔,如此反復作對倍稀釋至第7孔,后,從第7孔中吸出100 ul棄去,使之體積均為100 ul,。第8孔為空白對照。

2,、加樣:待測樣品孔中每孔各加入待測樣品100ul,。

3,、將反應板置于37 ℃×120 min。

4,、洗板:用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次,向濾紙上扣干,。

5、每孔中加入抗體工作液50ul,。

6,、將反應板充分混勻后置37 ℃×60 min。

7,、洗板:用洗滌液將反應板充分洗滌4~6次,向濾紙上扣干,。

8、每孔加酶標抗體工作液100ul,。

9,、將反應板置于37 ℃ 120 min。

10,、洗板:用洗滌液將反應板充分洗滌4~6次,向濾紙上扣干,。

11、每孔中加入底物工作液100ul, 置于37 ℃暗處反應5~10 min,。

12,、每孔中加入50ul終止液混勻。

13,、用酶標儀在492 nm處測吸光值,。