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原代細(xì)胞純化之酶消化法
閱讀：807 發(fā)布時(shí)間：2018-5-7原代細(xì)胞酶消化法是比較常用的純化方法,，不僅對(duì)貼壁細(xì)胞可行,，能利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同，使兩者分開(kāi),，達(dá)到純化的目的,，對(duì)貼壁細(xì)胞與半貼壁及粘附細(xì)胞間的分離純化也是十分有效的,。
(1)上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的分離純化
兩者在胰蛋白酶的作用下，由于成纖維細(xì)胞先脫壁,，而上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間才脫壁,，特別是在原代細(xì)胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯，故可采用多次差別消化方法將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開(kāi),，方法如下：
①采用常規(guī)消化傳代方式 將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)兩次,，每次加1mL(25mL培養(yǎng)瓶)來(lái)回輕搖1-2次，使胰蛋白酶流過(guò)所有細(xì)胞表面,，然后倒掉,。
②蓋好瓶塞(或蓋)，將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察,，發(fā)現(xiàn)纖維樣細(xì)胞變圓,，部分脫落，立即加入2mL有血清的培養(yǎng)液終止消化,。
③ 用彎頭吸管輕輕吹打纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)的區(qū)域(可事先在鏡下用記號(hào)筆在培養(yǎng)瓶上劃出記號(hào)),。吹打時(shí)不要用力，也不要吹打上皮細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)域,。吹打結(jié)束后,，再用少 量培養(yǎng)液漂洗一遍，然后加入適量培養(yǎng)液于瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng),，也可重復(fù)上述操作再進(jìn)行一次,，隔幾日后或下次傳代時(shí)，再進(jìn)行上述操作,，經(jīng)過(guò)幾次處理，就可將成纖維 細(xì)胞去除或?qū)烧叻珠_(kāi),。
(2)骨髓基質(zhì)肌樣細(xì)胞的純化
在血液細(xì)胞和骨髓細(xì)胞靜置培養(yǎng)時(shí),，常有許多肌樣細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，但也有 許多淋巴細(xì)胞,、單核細(xì)胞,、粒細(xì)胞粘附其上，種類(lèi)混雜,，鑒于粘附細(xì)胞貼壁不牢固,，也可用酶消化法使粘附細(xì)胞脫壁分離，以達(dá)到骨髓基質(zhì)細(xì)胞或血液中肌樣細(xì)胞與 淋巴細(xì)胞分開(kāi)和純化的目的,。其方法如下：
①待基質(zhì)或肌樣細(xì)胞基本形成單層時(shí),，倒去舊液，加入無(wú)鈣,、鎂PBS漂洗,，并用力搖動(dòng)后倒掉,，反復(fù)洗2~3次后，一方面可洗去血清和鈣鎂離子以助酶消化,，另一方面又可使大部分粘附細(xì)胞被洗掉,，但仍留有不少粘附細(xì)胞。
②將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),，每瓶1mL(25mL培養(yǎng)瓶),，輕輕搖動(dòng)讓胰蛋白酶流過(guò)細(xì)胞表面，作用1~2分鐘后再輕輕搖動(dòng)1~2次后倒去,。
③蓋好瓶蓋,，在普通顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)或肌樣細(xì)胞由于貼壁較牢固未脫壁,，而原先粘附的細(xì)胞已浮起,，此時(shí)再加2mL PBS洗一次倒掉，盡量除去粘附細(xì)胞,。
④加入含血清的培養(yǎng)基終止消化,，再繼續(xù)用力搖動(dòng)后倒掉，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),。隔幾日或下次傳代前,，再進(jìn)行上述操作，經(jīng)過(guò)幾次處理和傳代培養(yǎng)后就可將粘附原代細(xì)胞去除,，將兩者分開(kāi),，達(dá)到使骨髓基質(zhì)細(xì)胞或肌樣細(xì)胞純化的目的。
2592-95-2 1-羥基-苯并三氮唑(無(wú)水) (HOBt)（ 2-8℃） 英文名稱(chēng)： CAS號(hào)： 1-Hydroxybenzotriazole
123333-53-9 1-羥基苯并三唑一水 英文名稱(chēng)： CAS號(hào)： 1-Hydroxybenzotriazole hydrate
5315-79-7 1-羥基芘 英文名稱(chēng)： CAS號(hào)： 1-HYDROXYPYRENE
23074-42-2 1-氰基金剛烷 英文名稱(chēng)： CAS號(hào)： 1-Adamantanecarbonitrile
143-08-8 1-壬醇;第九醇;辛基甲醇 英文名稱(chēng)： CAS號(hào)： 1-Nonanol;Octyl carbinol;Pelargonic alcohol;Nonalol;Alcohol C-9
18156-74-6 1-*基硅咪唑 英文名稱(chēng)： CAS號(hào)： N-(Trimethylsilyl)imidazole
112-55-0 1-十二硫醇 英文名稱(chēng)： CAS號(hào)： 1-Dodecanethiol
原代細(xì)胞