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干細(xì)胞增殖檢測：3H同位素滲入法
閱讀：104 發(fā)布時間：2018-4-18一,、原理
干細(xì)胞在有絲分裂原PHA、ConA 等的刺激下,，產(chǎn)生增殖反應(yīng),，DNA和RNA合成明顯增加，如在培養(yǎng)液中加入3H－胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）,，則可被轉(zhuǎn)化中的細(xì)胞攝入,。測定標(biāo)記淋巴細(xì)胞的放射強(qiáng)度可反映淋巴細(xì)胞增殖的程度。
二,、儀器和材料
RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液,、小牛血清、2-巰基乙醇（2-ME）,、青霉素,、鏈霉素、刀豆蛋白A（ConA）,、Hank's液,、PBS緩沖液（pH7.2-7.4）、3H-TdR,、閃爍液[2,，5-二苯基惡唑（PPO）0.5g,、1，4-雙-（5-苯基惡唑基）-苯（POPOP）0.25g,、二甲苯500mL混勻]
200目篩網(wǎng),，96孔培養(yǎng)板（平底），手術(shù)器械,、二氧化碳培養(yǎng)箱,、超凈工作臺、液體閃爍儀,、多頭細(xì)胞取集器,、49型玻璃纖維濾紙。
三,、實(shí)驗(yàn)步驟
1,、脾細(xì)胞懸液制備
無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank's液的小平皿中,，用鑷子輕輕將脾撕碎,，制成單細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾,，用Hank's液洗3次,，每次離心10min（1000r/min）。然后將細(xì)胞懸浮于2mL的*培養(yǎng)液中,，用臺酚蘭染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù)（應(yīng)在95%以上）,，zui后用RPMI1640*培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)調(diào)成5×106個/mL。
2,、淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)
將脾細(xì)胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中,，200μL/孔，每一份脾細(xì)胞懸液分裝6個孔,，3孔加ConA（5ug/mL）,，另3個孔不加ConA 作為對照。置5% CO2,，37℃培養(yǎng)72h,，培養(yǎng)結(jié)束前6h，每孔加入3H-TdR 20μL,，使其終濃度為（3.7-18.5）×104Bq/mL,。用多頭細(xì)胞收集器將細(xì)胞取集于玻璃纖維濾紙上。濾紙片充分干燥后置測量瓶中,，加入7mL閃爍液,，用液閃儀測定每分鐘脈沖數(shù)（cpm）。
3、干細(xì)胞數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定
一般采用方差分析,，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),，方差齊，計算F值,，F(xiàn)值< F0.05,，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值≥F0.05,，P≤0.05,，用多個實(shí)驗(yàn)組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計,；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計。
以每分鐘脈沖數(shù)（cpm）表示增殖程度,，用刺激指數(shù)（SI）來表示
實(shí)驗(yàn)孔cpm
SI= ─────────
對照孔cpm
受試樣品組的SI值顯著高于對照組的SI值,，即可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。
Thiopental CIII 250mg 戊硫代巴比妥標(biāo)準(zhǔn)品 76-75-5
Thioridazine 200mg 硫利達(dá)嗪標(biāo)準(zhǔn)品 50-52-2
Thioridazine Hydrochloride 200mg 鹽酸硫利達(dá)嗪標(biāo)準(zhǔn)品 130-61-0
Thiostrepton 200mg 硫鏈絲菌素標(biāo)準(zhǔn)品 1393-48-2
Thiotepa 500mg 三亞乙基硫代磷酰胺標(biāo)準(zhǔn)品 52-24-4
Thiothixene 250mg 替沃噻噸標(biāo)準(zhǔn)品 3313-26-6
Thonzonium Bromide 200mg 通佐溴銨標(biāo)準(zhǔn)品 553-08-2
Thymol 500mg 百里酚標(biāo)準(zhǔn)品 89-83-8
Tiagabine Hydrochloride 300mg 鹽酸噻加賓標(biāo)準(zhǔn)品 145821-59-6
Tiagabine Related Compound A 15mg 噻加賓相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品
Tiamulin 100mg 泰妙菌素標(biāo)準(zhǔn)品 55297-95-5
Tiamulin Fumarate 250mg 延胡索酸泰妙菌素標(biāo)準(zhǔn)品 55297-96-6
干細(xì)胞