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大鼠Agouti相關(guān)蛋白（AGRP）ELISA檢測試劑盒說明書
閱讀：107 發(fā)布時間：2018-11-15| 提 供 商 | 上海研生實業(yè)有限公司 | 資料大小 | 140.1KB |
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大鼠Agouti相關(guān)蛋白（AGRP）ELISA檢測試劑盒檢測原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被大鼠Agouti相關(guān)蛋白（AGRP）捕獲抗體的包被微孔中,，依次加入標本,、標準品,、HRP標記的檢測抗體,，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠Agouti相關(guān)蛋白（AGRP）呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值）,，計算樣品濃度。
樣品收集,、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后,，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離,。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清,。
3. 細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清,。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測,，請按一次用量分裝，凍存于-20℃,，避免反復凍融,，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
酶標儀（450nm）
高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL,、20-200uL、200-1000uL
37℃恒溫箱
操作注意事項
試劑盒保存在2-8℃,，使用前室溫平衡20分鐘,。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象,，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。
實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存,。
預處理后的樣本無需稀釋，直接取10μL加樣即可,。
嚴格按照說明書中標明的時間,、加液量及順序進行溫育操作。
所有液體組分使用前充分搖勻,。
試劑盒組成
名稱
96孔配置
48孔配置
備注
微孔酶標板
12孔×8條
12孔×4條
無
標準品（32 ng/mL）
0.6mL
0.6mL
按說明書進行稀釋
標準品稀釋液
6mL
3mL
無
樣本稀釋液
6mL
3mL
無
檢測抗體-HRP
10mL
5mL
無
20×洗滌緩沖液
25mL
15mL
大鼠Agouti相關(guān)蛋白（AGRP）ELISA檢測試劑盒按說明書進行稀釋
底物A
6mL
3mL
無
底物B
6mL
3mL
無
終止液
6mL
3mL
無
封板膜
2張
2張
無
說明書
1份
1份
無
自封袋
1個
1個
無
注：標準品用標準品稀釋液依次稀釋為：32,、16、8,、4、2,、1 ng/mL.
試劑的準備
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。
洗板方法
手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液,，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干,，如此洗板5次,。
自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min,，洗板5次,。
操作步驟
從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。
設(shè)置標準品孔,、樣本孔和空白孔，空白孔什么都不加；標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,；
待測樣本孔先加樣本稀釋液40μL,，再加待測樣本10μL；
隨后標準品孔和樣本孔中（空白孔不加）加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL,，,，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液,，靜置1min,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）,。
所有孔加入底物A、B各50μL,，37℃避光孵育15min,。
所有孔加入終止液50μL，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值,。
結(jié)果判斷
繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標,，對應(yīng)OD值作縱坐標,，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值,。
試劑盒性能
1. 準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù)R值,，大于等于0.9900。
2. 靈敏度：zui低檢測濃度小于0.1 ng/mL,。
3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng),。
4. 重復性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%,。
5. 貯藏：2-8℃,，避光防潮保存。
6. 大鼠Agouti相關(guān)蛋白（AGRP）ELISA檢測試劑盒有效期：6個月