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鴨DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNMT3A）ELISA試劑盒技術(shù)參數(shù)
閱讀：168 發(fā)布時(shí)間：2018-8-7| 提 供 商 | 上海研生實(shí)業(yè)有限公司 | 資料大小 | 75.6KB |
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鴨DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNMT3A）ELISA試劑盒檢測(cè)原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,。往預(yù)先包被DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNMT3A）抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本,、標(biāo)準(zhǔn)品,、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNMT3A）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值）,，計(jì)算樣品濃度,。
樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞
刺激,，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地
分離,。
2. 血漿：EDTA,、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清,。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物,。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘
取上清,。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè),，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于
-20℃,，避免反復(fù)凍融,，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
1. 酶標(biāo)儀（450nm）
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL,、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
操作注意事項(xiàng)
1. 試劑盒保存在2-8℃,，使用前室溫平衡20 分鐘,。從冰箱取出的
濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象,，水浴加熱使結(jié)晶*溶解
后再使用,。2. 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存,。
3. 濃度為0 的S0 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品即可視為陰性對(duì)照或者空白,；按照說(shuō)明
書(shū)操作時(shí)樣本已經(jīng)稀釋5 倍，zui終結(jié)果乘以5 才是樣本實(shí)際濃度,。
4. 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)中標(biāo)明的時(shí)間,、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。
5. 所有液體組分使用前充分搖勻,。
試劑盒組成
名稱(chēng)96 孔配置48 孔配置備注
微孔酶標(biāo)板12 孔×8 條12 孔×4 條無(wú)
標(biāo)準(zhǔn)品0.3mL*6 管0.3mL*6 管無(wú)
樣本稀釋液6mL 3mL 無(wú)
檢測(cè)抗體-HRP 10mL 5mL 無(wú)
20×洗滌緩沖液25mL 15mL 按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋
底物A 6mL 3mL 無(wú)
底物B 6mL 3mL 無(wú)
終止液6mL 3mL 無(wú)
封板膜2 張2 張無(wú)
說(shuō)明書(shū)1 份1 份無(wú)
自封袋1 個(gè)1 個(gè)無(wú)
注：標(biāo)準(zhǔn)品（S0-S5）濃度依次為：0,、7.5、15,、30,、60、120 U/L
試劑的準(zhǔn)備
20×洗滌緩沖液的稀釋?zhuān)赫麴s水按1：20 稀釋?zhuān)? 份的20×洗滌緩
沖液加19 份的蒸餾水,。
鴨DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNMT3A）ELISA試劑盒洗板方法
1. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液，靜置1min 后甩盡
孔內(nèi)液體,，在吸水紙上拍干,，如此洗板5 次。
2. 自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL,，浸泡1min,，洗板5 次。
操作步驟
1. 從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封
袋密封放回4℃,。
2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；
3. 樣本孔先加待測(cè)樣本10μL,，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不
加,。
4. 除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶
（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴
鍋或恒溫箱溫育60min,。
5. 棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液,，靜置1min，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5 次（也可用洗板機(jī)洗板）,。
6. 每孔加入底物A、B 各50μL,，37℃避光孵育15min,。
7. 每孔加入終止液50μL，15min 內(nèi),，在450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的
OD 值,。
結(jié)果判斷
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel 工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),，對(duì)應(yīng)
OD 值作縱坐標(biāo),，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣
本濃度值,。
試劑盒性能
1. 準(zhǔn)確性：標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R 值,，大于等于
0.9900。
2. 靈敏度：zui低檢測(cè)濃度小于1.0 U/L,。
3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類(lèi)似物交叉反應(yīng)。
4. 重復(fù)性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于15%,。
5. 貯藏：2-8℃，避光防潮保存,。
6. 鴨DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNMT3A）ELISA試劑盒有效期：6 個(gè)月