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食管癌細(xì)胞；EC109操作步驟:

1,、貼壁細(xì)胞的消化

①吸除培養(yǎng)液,，用無菌 PBS、Hanks 液或無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次,，以去除殘余的血清,。

②加入少量生物 Trypsin-EDTA solution，略蓋過細(xì)胞即可,，室溫放置 0.5～2min,， 不同的細(xì)胞消化時(shí)間有所不同。

③顯微鏡下觀察,，細(xì)胞明顯收縮,，并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變

化,；或者用槍吹打細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞剛好可以被吹打下來，吸除細(xì)胞消化液,。加入含血清的  *細(xì)胞培養(yǎng)液,，吹打下細(xì)胞，即可直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),。

④如果發(fā)現(xiàn)消化不足,，則加入 Trypsin-EDTA solution 重新消化。

⑤如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞消化時(shí)間過長,，未及吹打細(xì)胞,，細(xì)胞已經(jīng)有部分直接從培養(yǎng)器皿底部脫落， 直接用細(xì)胞培養(yǎng)液把細(xì)胞全部吹打下來,。1000～2000g 離心 1min,，沉淀細(xì)胞，盡量去除細(xì)胞消化液后,，加入含血清的*培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞,，即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2,、組織的消化不同的組織需要消化的時(shí)間相差很大,，通常以消化后可以充分打散組織為宜。

冷凍保存細(xì)胞之方法

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 儲(chǔ)存,。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase儲(chǔ)存,。*-20 ℃不可超過1 小時(shí),， 以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡,，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中,，惟存活率稍微降低一些。