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食管癌細胞,；EC109操作步驟:

1、貼壁細胞的消化

①吸除培養(yǎng)液,，用無菌 PBS,、Hanks 液或無血清培養(yǎng)液洗滌細胞一次，以去除殘余的血清,。

②加入少量生物 Trypsin-EDTA solution,，略蓋過細胞即可，室溫放置 0.5～2min,， 不同的細胞消化時間有所不同,。

③顯微鏡下觀察,，細胞明顯收縮,，并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現細胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變

化；或者用槍吹打細胞發(fā)現細胞剛好可以被吹打下來,，吸除細胞消化液,。加入含血清的  *細胞培養(yǎng)液，吹打下細胞,，即可直接用于后續(xù)實驗,。

④如果發(fā)現消化不足，則加入 Trypsin-EDTA solution 重新消化。

⑤如果發(fā)現細胞消化時間過長,，未及吹打細胞,，細胞已經有部分直接從培養(yǎng)器皿底部脫落， 直接用細胞培養(yǎng)液把細胞全部吹打下來,。1000～2000g 離心 1min,，沉淀細胞，盡量去除細胞消化液后,，加入含血清的*培養(yǎng)液重新懸浮細胞,，即可用于后續(xù)實驗。

2,、組織的消化不同的組織需要消化的時間相差很大,，通常以消化后可以充分打散組織為宜。

冷凍保存細胞之方法

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 儲存,。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下,， 再放入液氮槽vapor phase儲存。*-20 ℃不可超過1 小時,， 以防止冰晶過大,，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中,，惟存活率稍微降低一些,。