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原代細(xì)胞的測(cè)定方法
閱讀：279 發(fā)布時(shí)間：2018-5-31實(shí)驗(yàn)原理
原代細(xì)胞染色單體或染色體的無(wú)著絲點(diǎn)斷片,，或因紡錘體受損而丟失的整個(gè)染色體，在細(xì)胞分裂后期,，仍然在細(xì)胞質(zhì)中,。末期之后，單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核,，被包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi),，因比主核小，故稱(chēng)為微核,。大小應(yīng)為主核的1/20～1/5,。微核的折光率及細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和主核一樣。微核率是和用藥的劑量或輻射累積效應(yīng)呈正相關(guān),，所以可用簡(jiǎn)易的,、快速、靈敏的微核計(jì)數(shù)來(lái)代替繁雜的畸變?nèi)旧w計(jì)數(shù),。Matter 和Schmid建立的微核測(cè)試是一種比較理想的方法,，目前國(guó)內(nèi)外已把微核測(cè)試用于輻射損傷、化學(xué)誘變劑,、新藥試驗(yàn),、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。
實(shí)驗(yàn)對(duì)象
成年健康小鼠,，體重25g左右,，雌雄均可。
實(shí)驗(yàn)試劑與器材
（1）器材：顯微鏡,、低速離心機(jī),、電子天平、解剖器械（搪瓷解剖盤(pán)、探針,、剪刀,、鑷子）、注射器,、試管,、試管架、磨口試劑瓶,、滴管,、染色缸、洗耳球,、量筒,、清潔載玻片。
（2）試劑：0.9％生理鹽水,、滅活的小牛血清,、環(huán)磷酰胺、甲醇,、PBS (pH6.8),、Giemsa染液、瑞氏染液,。
實(shí)驗(yàn)方法與步驟
（1）環(huán)磷酰胺處理：取骨髓前24h先給小鼠腹腔注入環(huán)磷酰胺,，注射劑量為100mg／kg動(dòng)物體重。
（2）取骨髓：用損傷脊髓法處死小鼠,，然后用剪刀剪開(kāi)大腿上的皮膚和肌肉,，取出大腿骨，用一小塊紗布來(lái)回搓干凈附在骨上的肌肉碎渣,。剪掉股骨兩端膨大的關(guān)節(jié)頭,，然后用注射器吸取5ml生理鹽水，插入股骨一端,，將骨髓細(xì)胞沖洗至10ml的離心管中,。可重復(fù)沖洗多次,，直至骨髓腔呈白色為止。
（3）離心處理：將所獲得的細(xì)胞懸浮液以1000rpm離心10min,，吸去上清液,，在沉淀物中加入2滴滅活的小牛血清，制成細(xì)胞懸液,。
（4）涂片：滴一滴懸液于載玻片一端,，按常規(guī)方法涂片，在空氣中晾干。
（5）固定：將晾干的載玻片放入甲醇固定液中10min,，取出晾干,。
（6）染色：將制片平放在玻璃板上，用1∶9∶10的Giemsa∶PBS∶瑞氏染液,，染色15min,，流水沖洗后晾干即可鏡檢。
（7）觀察：嗜多染紅細(xì)胞為年幼紅細(xì)胞,，呈灰藍(lán)色,，略大于紅細(xì)胞（紅色），微核多呈圓形和橢圓形,，呈藍(lán)紫色或紫紅色（圖13-3）,。
（8）結(jié)果分析：在顯微鏡下，每只小鼠骨髓涂片標(biāo)本計(jì)數(shù)1000~2000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞,，包括其中出現(xiàn)微核的細(xì)胞數(shù),，將結(jié)果填入表內(nèi)，并計(jì)算微核細(xì)胞率,，觀察記錄結(jié)果（表13-2）,。按100mg/kg體重劑量給小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，其嗜多染紅原代細(xì)胞微核率為（48.9±3.6）％,。正常小鼠嗜多染紅細(xì)胞微核率為5‰以下,，超過(guò)5‰為異常。
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