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熒光假單胞菌探針發(fā)熒光定量PCR試劑盒說明書
閱讀：247 發(fā)布時間：2024-6-4| 提 供 商 | 上海研生實業(yè)有限公司 | 資料大小 | 12.9KB |
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熒光假單胞菌探針發(fā)熒光定量PCR試劑盒說明書
產(chǎn)品及特點熒光假單胞菌是一種環(huán)境污染菌,。對于人類是一種罕見的機(jī)會致病菌,?？蓮膫凇⑻?、胸水,、尿和血液中分離出來，也可從血庫存在中分離出,?？稍诒鋬Υ娴难杭把褐破分蟹敝?，而且自溶后釋放內(nèi)毒素。其內(nèi)毒素的磷脂部分,，可導(dǎo)致輸血后不可逆的休克,。因此快速靈敏檢測熒光假單胞菌具有重要意義。本產(chǎn)品就是為此目的根據(jù) PCR 原理開發(fā)的試劑盒,，它具有下列特點：
1.即開即用,，用戶只需要提供 DNA 模板。
2.引物經(jīng)過精心優(yōu)化,，專一性強(qiáng),，只擴(kuò)增熒光假單胞菌，與其他微生物沒有交叉反應(yīng),。
3.提供陽性對照,，便于區(qū)分假陰性樣品。
4.PCR mix 中含上樣染料,，PCR 后可以直接上樣電泳,。
1.本試劑盒足夠做 40μL 體系的 PCR 50 次，但只能用于科研,。
熒光假單胞菌探針發(fā)熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分成分 包裝
2×Probe qPCR MagicMix500μL ）
熒光 PCR 專用模板稀釋液1mL
熒光假單胞菌探針法 qPCR
引物-探針混合液150μL ）
熒光假單胞菌探針法 qPCR 陽性
對照(1×10E7 拷貝/μL)50μL
使用手冊1 份
運輸及保存低溫運輸,，-20℃保存，保存期限為 12 個月,。
自備試劑樣品 DNA,。
使用方法一、稀釋PCR 陽性對照（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）
如果做定性實驗,，則此步可以跳過,。如果做定量實驗，則需要稀釋陽性對照做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照， 只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照,。
1.標(biāo)記 6 個離心管,，分別為 6，5,，4,，3，2,，1,。
2.用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭,，下同）。
3.在 6 號管中加入 5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照（試劑盒提供）,，充分震蕩 1 分鐘，
得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。
4.換槍頭，在 5 號管中加入 5μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。
5.換槍頭,，在 4 號管中加入 5μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照（上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。
6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。二、樣品 DNA 的制備
7.如果有 N 個樣品,，必須設(shè)置 N+2 個提取,，多出的一個是樣品制備 PC（樣品制備陽性對照），一個是樣品制備 NC（樣品制備陰性對照）,?？梢杂?10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為樣品制備 PC,。另外用水作為樣品制備 NC,。
8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容,。三,、Probe qPCR 反應(yīng)熒光假單胞菌探針發(fā)熒光定量PCR試劑盒（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板）,，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管中的陽性對照稀釋液做模板）,。下面只以定量分析為描述操作步驟,，
10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
11.蓋上蓋子后上機(jī),，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：
過程溫度時間
預(yù)變性95℃2min
qPCR 反應(yīng)
（40 個循環(huán)）95℃15sec
55℃30sec（采集 FAM 通道的熒光信號）
72℃30sec
四、熒光假單胞菌探針發(fā)熒光定量PCR試劑盒數(shù)據(jù)處理
12.如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度。
13.如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品,， 如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,，
則重復(fù)一次,。重復(fù)實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40,，則為陽性,。
產(chǎn)品CAT#:BH5216-51
低溫運輸，-20℃保存