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鯉春病毒（SVCV）核酸檢測試劑盒 技術參數(shù)
閱讀：501 發(fā)布時間：2020-4-10| 提 供 商 | 上海研生實業(yè)有限公司 | 資料大小 | 13.9KB |
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鯉春病毒(SVCV)核酸檢測試劑盒說明書
產(chǎn)品名稱鯉春病毒(SVCV)核酸檢測試劑盒 48T
組成及試劑配制:
1,、酶標板：一塊（96孔）
2,、 標準品（凍干品）： 2瓶,，請臨用前15分鐘內(nèi)配制,。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml,，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為200 U/L,，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L,，100 U/L，50 U/L,，25 U/L,，12.5 U/L，6.25 U/L,，3.12 U/L,，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推。
3,、 樣品稀釋液：1×20ml,。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5,、 檢測稀釋液B：1×10ml,。
【標本要求】
人體鼻腔或咽部分泌物:用無菌捻拭子拭取鼻腔或咽部分泌物，將分泌物或咽拭子置入無菌玻璃管（含0.4ml滅菌生理鹽水）,，用無菌棉球將試管塞緊后,，密閉送檢。標本可立即用于檢測,，也可保存于-20℃待測,。
鯉春病毒(SVCV)核酸檢測試劑盒 檢驗方法
1.標本、對照品的核酸裂解處理
用商品化（取得醫(yī)療器械許可證）的RNA提取試劑盒處理標本,，具體操作參見該試劑盒說明書,。
或用Trizol法提取，方法如下：取100?l樣品置于1.5ml 離心管中,，加入300?l裂解液（Trizol）,，再加入100， 混勻器上振蕩混勻5sec或顛倒混勻15次,； 13000rpm離心15min,， 吸取上層液體，加入等體積異丙醇,，顛倒混勻室溫靜置10min,， 13000rpm離心10min，輕輕倒去上清,；加入700?l 75%乙醇,，顛倒洗滌，13000rpm離心5min,，輕輕倒去上清,，倒置于吸水紙上，棄盡液體或4000rpm離心5sec,，將管壁上的殘余液體甩到管底部,，用微量加樣器盡量吸干液體，加入20?l DEPC-H2O溶解RNA,。
2.試劑配制
取n×19?l H7N9核酸熒光PCR檢測混合液與n×1?l RT-PCR酶（n為反應管數(shù)）,振蕩混勻數(shù)秒, 3000rpm離心數(shù)秒,。
3.加樣取上述混合液20?l置于PCR管中，然后將樣品核酸提取液,、DEPC-H2O,、陽性對照品各5?l分別加入PCR管中，蓋好管蓋,，立即進行PCR擴增反應,。
4. PCR擴增反應管置于定量熒光PCR儀上,，推薦循環(huán)參數(shù)設置：
45℃×10min; 95℃×15min;循環(huán)一次，再按95℃×15sec→60℃×60sec,，循環(huán)45次;單點熒光檢測在60℃,，反應體系為25?l。
熒光通道檢測選擇：選用FAM通道,。
樣本采集,、存放及運輸：
1、樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集,；
2,、存放：樣本在2~8℃條件下保存應不超過72h，-70℃以下可長期保存,，但應避免反復凍融（zui多凍融3次）,；
3、運輸：采用泡沫箱加冰密封進行運輸,。
反應五要素:
參加PCR反應的物質主要有五種即引物,、酶、dNTP,、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特異性反應的關鍵,，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,，只要知道任何一段模板DNA序列,， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增,。設計引物應遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp,，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜,，特定條件下可擴增長至10kb的片段,。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳,，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結構，避免兩條引物間互補,，特別是3'端的互補,，否則會形成引物二聚體，鯉春病毒(SVCV)核酸檢測試劑盒 產(chǎn)生非特異的擴增條帶,。
⑤引物3'端的堿基,，特別是末及倒數(shù)第二個堿基,，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗,。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點,， 被擴增的靶序列有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處,。
⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性,。
引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以低引物量產(chǎn)生所需要的結果為好,，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,，且可增加引物之間形成二聚體的機會。