化工儀器網(wǎng)
資料下載
人乙酰膽堿酯酶（AchE）ELISA試劑盒實驗原理
閱讀：102 發(fā)布時間：2019-3-1| 提 供 商 | 上海研生實業(yè)有限公司 | 資料大小 | 28.1KB |
|---|---|---|---|
| 資料圖片 | 下載次數(shù) | 32次 | |
| 資料類型 | WORD 文檔 | 瀏覽次數(shù) | 102次 |
| 免費下載 | 點擊下載 |
本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定人血清，血漿及相關(guān)液體樣本中乙酰膽堿酯酶（AchE）含量,。
實驗原理：
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中人乙酰膽堿酯酶（AchE）水平,。用純化的人乙酰膽堿酯酶（AchE）抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被的微孔中依次加入乙酰膽堿酯酶（AchE）,，再與HRP標記的乙酰膽堿酯酶（AchE）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色,。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的乙酰膽堿酯酶（AchE）呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，通過標準曲線計算樣品中人乙酰膽堿酯酶（AchE）含量。
試劑盒組成：
試劑盒組成 48孔配置 96孔配置 保存
說明書 1份 1份
封板膜 2片（48） 2片（96）
密封袋 1個 1個
酶標包被板 1×48 1×96 2-8℃保存
標準品：2250nmol/L 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存
標準品稀釋液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保存
酶標試劑 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
樣品稀釋液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
顯色劑A液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
顯色劑B液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
終止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
濃縮洗滌液 （20ml×20倍）×1瓶 （20ml×30倍）×1瓶 2-8℃保存
樣本處理及要求：
?血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心,。
?血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA、者檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次離心。
?尿液：用無菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。胸腹水、腦脊液參照實行,。
?細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時,，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液,，細胞濃度達到100萬/ml左右,。通過反復(fù)凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。
?組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS,，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩吮救诨笕匀槐３?-8℃的溫度,。加入一定量的PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用,。
?標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設(shè)標準品孔10孔,，在、第二孔中分別加標準品100μl,，然后在,、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻,；然后從孔,、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三,、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻,；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,，再各取50μl分別加到第五、第六孔中,，再在第五,、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻,；混勻后從第五,、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中,，再在第七,、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七,、第八孔中分別取50μl加到第九,、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl,，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉,。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為1500nmol/L，1000nmol/L,，500nmol/L,，250nmol/L，125nmol/L）,。
?加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑,，其余各步操作相同）、待測樣品孔,。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測樣品10μl（樣品終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻。
?溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。
?配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用,。
?洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次,，拍干。
?加酶：每孔加入酶標試劑50μl,，空白孔除外,。
?溫育：操作同3。
?洗滌：操作同5,。
?顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘.
?終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
?測定：以空白空調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。
?試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,，酶標包被板開封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
?濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,，洗滌時不影響結(jié)果,。
?各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性,，以避免試驗誤差,。一次加樣時間建議控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。
?請每次測定的同時做標準曲線，建議做復(fù)孔,。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔孔的OD值）,，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。
?封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染。
?底物請避光保存,。
?嚴格按照說明書的操作進行,，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
?所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。
?本試劑不同批號組分不得混用,。
?如與英文說明書有異，以英文說明書為準,。
計算：
以標準物的濃度為橫坐標,，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度。
（此圖僅供參考）
試劑盒性能：
?樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上,。
?批內(nèi)與批間應(yīng)分別小于9%和11%
檢測范圍：
100nmol/L-2000nmol/L
保存條件及有效期：
?試劑盒保存：2-8℃,。
有效期：6