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人哇巴因（Ouabain）ELISA試劑盒使用方法
閱讀：127 發(fā)布時間：2018-11-8| 提 供 商 | 上海研生實業(yè)有限公司 | 資料大小 | 75.6KB |
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| 資料類型 | JPG 圖片 | 瀏覽次數(shù) | 127次 |
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試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,。往預(yù)先包被人哇巴因（Ouabain）捕獲抗體的包被微孔中,，依次加入標(biāo)本,、標(biāo)準(zhǔn)品,、HRP標(biāo)記的檢測抗體,，經(jīng)過溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的人哇巴因（Ouabain）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度,。
樣本處理及要求
1. 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000g離心20分鐘,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果）,，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS,，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄,。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中,，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞,，可以對勻漿液進行超聲破碎,，或反復(fù)凍融。zui后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,，取上清檢測,。
4. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測,。
標(biāo)本處理
1. 本公司只對試劑盒本身負責(zé),，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責(zé)，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量,，預(yù)留充足的樣本,。
2. 實驗前應(yīng)預(yù)測標(biāo)本含量，如果標(biāo)本濃度過高,，應(yīng)對標(biāo)本進行稀釋,，使稀釋后的標(biāo)本符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),。標(biāo)本使用0.01mol/L的PBS稀釋(PH=7.0-7.2),。
3. 若所檢樣本不包含在說明書所列樣本之中，建議進行預(yù)實驗驗證其有效性,，并注意留存樣本,。
4. 使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細胞提取液可能會由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致ELISA實驗結(jié)果偏差。
5. 若樣本為細胞培養(yǎng)上清,，因該類樣本干擾因素較多,，如：細胞狀態(tài)、細胞數(shù)量,、采樣時間等,，所以可能存在檢測不出的情況。
6. 某些天然蛋白或重組蛋白,，包括原核及真核重組蛋白,，可能因為與本產(chǎn)品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測出,。
7. 建議使用新鮮樣本,，保存時間過長可能會存在蛋白降解或變性導(dǎo)致實驗結(jié)果偏差。
需要而未提供的試劑和器材
酶標(biāo)儀（450nm）
高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL,、20-200uL、200-1000uL
37℃恒溫箱
蒸餾水或去離子水
試劑盒組成
名稱
96孔配置
48孔配置
備注
微孔酶標(biāo)板
8孔×12條
8孔×6條
無
標(biāo)準(zhǔn)品
0.3mL*6管
0.3mL*6管
無
樣本稀釋液
6mL
3mL
無
檢測抗體-HRP
10mL
5mL
無
20×洗滌緩沖液
25mL
15mL
人哇巴因（Ouabain）ELISA試劑盒按說明書進行稀釋
底物A
6mL
3mL
無
底物B
6mL
3mL
無
終止液
6mL
3mL
無
封板膜
2張
2張
無
說明書
1份
1份
無
自封袋
1個
1個
無
備注：
1. 標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：80,、40,、20、10,、5,、0 pg/mL
2. 經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi),，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可,。當(dāng)有部分樣本值超過zui大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時,，可用樣本稀釋液將標(biāo)本進行適當(dāng)稀釋后再進行實驗。
注意事項
嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果,。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃,。使用后立即冷藏保存試劑。
洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果,。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉,。
消除板底殘留的液體和手指印,，否則影響OD值。
底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色,，已經(jīng)變藍的底物液不能使用,。
避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。
在儲存和溫育時避免強光直接照射,。
平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上,。
任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性,。
不能使用過期產(chǎn)品,。
如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。
試劑準(zhǔn)備
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水,。
操作步驟
1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。
2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3. 樣本孔中加入待測樣本50μL,；空白孔不加,。
4. 除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5. 棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6. 每孔加入底物A,、B各50μL,，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值。
實驗結(jié)果計算
以所測標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo),，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo),，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到直線回歸方程,，將樣品的OD值代入方程,，計算出樣品的濃度。
試劑盒性能
1. 檢測范圍：2.5 pg/mL – 80 pg/mL,。
2. 靈敏度：zui低檢測濃度小于0.1 pg/mL,。
3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
4. 人哇巴因（Ouabain）ELISA試劑盒重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ,，板間變異系數(shù)小于15% ,。