化工儀器網(wǎng)
資料下載
人糖缺失性轉(zhuǎn)鐵蛋白（CDT）ELISA試劑盒實驗原理
閱讀：123 發(fā)布時間：2018-8-9| 提 供 商 | 上海研生實業(yè)有限公司 | 資料大小 | 75.6KB |
|---|---|---|---|
| 資料圖片 | 下載次數(shù) | 78次 | |
| 資料類型 | JPG 圖片 | 瀏覽次數(shù) | 123次 |
| 免費下載 | 點擊下載 |
人糖缺失性轉(zhuǎn)鐵蛋白（CDT）ELISA試劑盒實驗原理
用純化的CDT抗體包被微孔板，制成固相載體,，往微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的CDT抗體、HRP標記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物（TMB）顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的CDT呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度,。
試劑盒組成及試劑配制
1、 酶標板：一塊（96孔）
2,、 標準品（凍干品）： 2瓶,，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘,，同時反復顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為100 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋）,，分別配制成100 U/L,，50 U/L，25 U/L,，12.5 U/L,，6.25 U/L，3.12 U/L,，1.56 U/L,，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制50 U/L標準品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）100 U/L的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推。
3,、 樣品稀釋液：1×20ml,。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml,。
5,、 檢測稀釋液B：1×10ml。
6,、 檢測溶液A：1×120 /瓶（1:100）,。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋（如：10 檢測溶液A / 990 檢測稀釋液A），充分混勻,，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（100 /孔）,，實際配制時應多配制 0.1-0.2ml。
7,、 檢測溶液B：1×120 /瓶（1:100）,。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A,。
8,、 底物溶液：1×10ml/瓶。
9,、 濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
10,、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）。
11、覆膜：5張
12,、使用說明書：1份
自備物品
1,、 酶標儀（建議儀器使用前提前預熱）
2、 微量加液器及吸頭,，EP管
3,、 蒸餾水或去離子水，濾紙
標本的采集及保存
1,、 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4 過夜后于1000 g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存,，但應避免反復凍融,。
2、 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標本采集后30分鐘內(nèi)于 1000 g離心15分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存,，但應避免反復凍融,。
3、 其它生物標本：請1000 g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保 存，但應避免反復凍融,。
注：以上標本均應密封保存,，4 保存應小于1周，-20 不應超過1個月,，-80 不應超過2個月,；標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。
人糖缺失性轉(zhuǎn)鐵蛋白（CDT）ELISA試劑盒操作步驟
實驗開始前,，各試劑均應平衡至室溫，試劑不能直接在37 溶解,；試劑或樣品配制時,，均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡,。實驗前應預測樣品含量,，如樣品濃度過高時，應對樣品進行稀釋,，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,，計算時再乘以相應的稀釋倍數(shù),。
1、 加樣：分別設空白孔,、標準孔,、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?100 ,，余孔分別加標準品或待測樣品100 ，注意不要有氣泡,，加樣 時將樣品加于酶標板底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,，酶標板加上蓋或覆膜,，37 溫育2小時。為保證實驗結(jié)果有效
性,，每次實驗請使用新的標準品溶液,。
2、 棄去液體,，甩干,，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100 （臨用前配制）,，酶標板加上覆膜,，37 溫育1小時。
3,、 棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板 3次,，每次浸泡1-2分鐘,，大約400 /每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。
4,、 每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100 ，加上覆膜,，37 溫育1小時,。
5、 棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板5次，方法同步驟3,。
6,、 每孔加底物溶液90 ,，酶標板加上覆膜37 避光顯色（反應時間控制在15-30分鐘，當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色,，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）,。
7,、 每孔加終止溶液50 ，終止反應,，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色,。終止液的加入順序應盡量與底物 液的加入順序相同。
8,、 立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度（OD值）,。
注：
1、 試劑準備：所有試劑在使用前應平衡至室溫,，使用后請立即按照說明書要求保存試劑,。實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染,。
2,、 加樣：加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,，將會導致不同的 “預溫育”時間,，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi),。推薦設置復孔進行實驗,。
3、 溫育：為防止樣品蒸發(fā),，實驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi),，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應盡快進行下步操作,，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài),；同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
4,、 洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干,，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印,，避免影響zui后的酶標儀讀數(shù),。
5、 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理,，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底,。標準品,、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用,，并使用相應的稀釋液配制,，不能混淆。請 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒配制標準品及工作液,，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時,，一次不要小于10 ），以避免由于不準確稀 釋而造成濃度誤差,；請勿重復使用已稀釋過的標準品,、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液,。
6,、 反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘）,，如顏色較深,，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù),。
7,、 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射,。
洗板方法
1,、 手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體,，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次,；根據(jù)需要,，重復此過程數(shù)次。
2,、 自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的人CDT,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應,。
計算
各標準品及樣本OD值扣除空白孔OD值后作圖（七點圖），如設置復孔,，則應取其平均值計算,。以標準品的濃度為縱坐標（對數(shù)坐標），OD值為橫坐標（對數(shù)坐標）,，在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,，如curve expert 1.3，根據(jù)樣品OD值,，由標準曲線查出相應的濃度,，乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度。
說明
1. 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果,。
2. 小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度,。請注意在吸取標本 / 標準品，酶結(jié)合物或底物時,，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,，將會導致不同的 “預孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性,。而且,，洗滌不充分將影響試驗結(jié)果。
3. 試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃,，部分試劑保存于2-8℃,，具體以標簽上的標示為準。
4. 濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。
5. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
6. 中,、英文說明書可能會有不一致之處,，請以英文說明書為準。
7. 所有的樣品都應管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。
8. 人糖缺失性轉(zhuǎn)鐵蛋白（CDT）ELISA試劑盒有效期：6個月